实验三+酸性磷酸酶的组织器官定位

实验三植物体内酸性磷酸酶的组织定位

一、实验目的

1、掌握植物体内酸性磷酸酶的金属盐―铅法染色进行组织定位的原理与技术。

2、掌握制作徒手切片的技术。

二、实验原理

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)广泛分布于机体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体的标志酶，此外，还存在于内质网和胞质内。在核酸和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与酯类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定生物学意义。

酸性磷酸酶金属盐―铅法，其基本原理是在酸性环境下，底物β―甘油磷酸钠被酸性磷酸酶水解，释放出磷酸，磷酸遇铅离子则生成磷酸铅沉淀，最后与硫化铵作用形成棕褐色硫化铅沉淀。

三、实验材料、试剂和仪器

1、实验材料：甘蓝叶片与小白菜叶片。

2、实验试剂：丙酮、β―甘油磷酸钠溶液、2%硫化铵等。

3、实验用品：刀片、镊子、培养皿、托盘等。

四、实验步骤

1、甘蓝叶脉染色

（1）徒手切片的制作：在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住甘蓝叶脉，右手平稳地拿住刀片。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，自左前方向右后方均匀地拉切。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用于材料染色。

（2）将一部分材料薄片铺在载玻片上，滴加蒸馏水铺平材料，加入1滴冰的丙酮溶液，固定15min。固定完成后，用蒸馏水水洗，一边滴加蒸馏水，一边用吸水纸吸，反复2-3次。用滴管慢慢的将切片挑起来，放置在含有10ml的底物溶液中，37℃保温1h。将切片用蒸馏水水洗2~3次后，放置在含有2% 的硫化铵溶液中1-2min，蒸馏水水洗2-3次。将染色的切片盖上盖玻片，制作成临时玻片。显微镜下观察，拍照记录染色结果。

（3）将另一部分切片放置蒸馏水中加热用作空白对照。其余操作同上。

2、小白菜根系染色

（1）将小白菜的根系蒸馏水洗净后，用刀切开，一半用于组织染色，另一半放在蒸馏水中加热煮死，作为空白对照。

（2）将根系放置在含有冰的丙酮溶液中固定15min，用蒸馏水水洗2~3次。固定完

成后，将根系放置在含有10ml的底物溶液中，37℃保温1h，用蒸馏水水洗2~3次后，放置在含有2%的硫化铵溶液中1-2min，蒸馏水水洗2~3次。将染色的材料放在有蒸馏水托盘中，观察染色结果。

五、实验结果

图1 小白菜根系酸性磷酸酶的组织染色图

注：从左至右依次为未施肥对照组；未施肥实验组；施肥对照组；施肥实验组。

图2 甘蓝叶脉酸性磷酸酶的组织染色图

注：左为实验组，右为对照组。

六、实验讨论

由图1和图2可知，材料染色后都有不同程度的褐变情况。其中施肥材料比未施肥材料的褐变程度大，染色后的颜色更深。从结果来看，对照组也有不同程度的染色，其原因可能是高温处理的时间不够，没有使酸性磷酸酶彻底失活，使其还具有酸性磷酸酶的部分活性，因此出现对照也染色的情况。由图2可以看出，叶脉的薄壁组织和维管组织都有变褐的情况，并且维管组织的染色较深，说明酸性磷酸酶在薄壁组织和维管组织都存在，并且维管组织中酸性磷酸酶的酶活性较高。