7发酵工艺控制(第3节 发酵条件的影响及其控制)

（3）温度影响生物合成的方向。
例如：四环素发酵中金色链霉菌在低于30℃ 下，合 成金霉素的能力较强。合成四环素的比例随温度的升高 而增大，在35℃下只产生四环素。
（4）近年来发现温度对代谢有调节作用。
例如：在20℃，氨基酸合成途径的反馈抑制作用 比在37℃的更大。故可考虑在抗生素发酵后期降低温 度，让蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些，从 而使发酵代谢转向产物合成。
7 发酵工艺控制
（第3节）
第三节 发酵条件的影响及其控制
常规条件： 罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、
液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等 的设定和控制；
表征过程性质的状态参数：
pH、溶氧(DO)、溶解CO2、氧化还原电位(rH)， 尾气O2和CO2含量、基质(如葡萄糖)或产物浓度、代谢 中间体或前体浓度、菌浓(以OD值或细胞干重DCW等 代表)等。
温度选择应参考其他发酵条件，灵活掌握。
①、供氧条件差的情况下： 最适发酵温度比在正常情况低一些。这是由于
在低温下氧溶解度相应大一些，菌的生长速率小一 些，从而弥补了因供氧不足而造成的代谢异常。
②、培养基的成分和浓度：
使用稀薄或较易利用的培养基时提高发酵温度则养 分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，产量降低。
会同时促进菌的衰老，但已临近放罐，无碍大局。
例3：青霉素发酵的变温控制：
0~5 h ，30℃；5~40 h，25℃；40~125 h， 20℃； 125~165 h ，25℃。
变温培养比25℃恒温培养提高青霉素产量近15％。 这些例子说明通过最适温度的控制可以提高抗生素 的产量，进一步挖掘生产潜力还需注意其他条件的配合。
嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌和嗜高温菌的最适生长温度 分别为18℃、37℃、55℃和85℃左右，其共同特点是：低 温范围的适应力强于高温范围的适应能力；生长温度的跨 度为30℃左右。
温度对比生长速率与比死亡速率的影响：
微生物生长速率数学模型：
dx/dt＝μx-ax
(7-31)
式中：μ为比生长速率；a为比死亡速率。
2、 最适pH的选择
准则： 获得最大比生产速率和适当的菌量，以获得最
高产量。
举例：利福霉素生产的PH控制：
在生长期葡萄糖的利用情况对利福霉素B的生产有一 定的影响。最适pH在7.0~7.5范围。
pH7.0时，平均得率系数达最大值；pH6.5时为最小。 故pH7.0是最佳条件。此条件下葡萄糖的消耗主要用于合 成产物，同时也能保证适当的菌量。
种子量多，胞外水解酶类多，有利于基质的利用。 生产菌迅速占优势，减少染菌机会。
接种量过大的缺点： 菌种生长过快，培养液黏度增加，导致溶氧不足，
影响产物的合成
四、 温度对发酵的影响
微生物生长和产物合成均需在各自适合的温度下 进行。
1、 温度对微生物生长的影响
不同微生物最适生长温度和耐受温度范围各异。
常用NaOH或Ca(OH)2调节pH，但也需注意培养基 的离子强度和产物的可溶性。
在培养液的缓冲能力不强的情况下pH变化可反映 菌的生理状况。
例如：
pH 上 升 超 过 最 适 值 ， 意 味 着 菌 处 在 饥饿状态，可加糖调节。加糖过量又会使 pH下降。
六、 溶氧的影响
这说明黄单孢菌的最适生长温度在24~27℃之间， 最适黄原胶形成温度在30～33℃之间。在20～25h进行 变温发酵对前期生长和中后期产胶有利。
例2：四环素发酵的温度控制
1) 0～30h，以稍高温度促进生长，尽可能缩短发酵周 期。
2) 30～150 h以稍低温度维持较长的抗生素生产期， 3) 150 h后又升温，以促进抗生素的分泌。虽然这样做
例如，提高红霉素发酵温度在玉米浆培养基中的效 果就不如在黄豆饼粉培养基的好，因提高温度有利于黄 豆饼粉的同化。
五 pH的影响
pH是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数 是代谢活动的综合指标。
因此，必须掌握发酵过程中pH变化的规律，及时监控， 使它处于生产的最佳状态。
1、发酵过程中pH变化的规律
恒化器——研究温度对发酵影响的最佳手段
在分批发酵中研究温度的影响有很大的局限性。因产 量的变化究竟是温度的直接影响还是因生长速率或溶氧浓 度变化的间接影响难于确定。
用恒化器可控制其他与温度有关的因素，如生长速率 等的变化，使在不同温度下保持恒定，从而能不受干扰地 判断温度对代谢和产物合成的影响。
3、 最适温度的选择
举例：青霉素发酵中PH的控制：
按菌的生理 代谢需要，调节 加糖速率来控制 pH，比用恒速加 糖，pH由酸碱控 制可提高青霉素 的产量25％。
有 些 抗 生 素 品 种 ， 如 链 霉 素 ， 采 用 过 程 通 NH3 控 制 pH，既调节了pH，也补充了N源。用氨水需谨慎，过量 的NH3会使微生物中毒，导致呼吸强度急速下降。故在 通氨过程中监测溶氧浓度的变化可防止菌的中毒。
pH的变化会影响各种酶活、菌对基质的利用速率和细 胞的结构，从而影响菌的生长和产物的合成。
例如：
产黄青霉细胞壁厚度随pH增加而减小。其 菌丝直径pH 6.0时为23μm；pH 7.4时为2~18μm， 呈膨胀酵母状细胞，随pH下降菌丝形状将恢复正 常。
pH值还会影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透 性的变化，从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分 泌。
培养基过于丰富或缺乏的影响：
a. 营养过于丰富，菌生长过盛，发酵液黏稠，传质状况 差。细胞不得不花费许多能量来维持其生存环境，即 用于非生产的能量倍增，对产物合成不利。
• 营养缺乏，影响菌体生长和产物形成。
碳源浓度对产物形成的影响：
例1：酵母crabtree效应。高糖度下，即使溶氧充足，它 还会进行发酵产生乙醇。
通过直接状态参数求得的间接状态参数：
比 生 产 速 率 (μ) 、 摄 氧 率 (OUR) 、 CO2 释 放 速 率 (CER)、呼吸商(RQ)、氧得率系数(Yx/o)、氧体积传质 速率(KLa)、基质消耗速率(Qs)、产物合成速率(Qp)等。
常用的工业发酵仪器
决定发酵水平的因素：
1、生产菌种的特性。 2、发酵条件的控制。 为了掌握生产菌种在发酵过程的代谢规律，可通过 各种监测手段了解各种状态参数随时间的变化，并予以 有效的优化控制。
2、 温度对发酵的影响
（1）温度对生长和生产的影响是不同的。 温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生
产期提前。但酶很易因过热而失活，菌体容易衰老， 发酵周期缩短，影响最终产量。
（2）温度还通过改变发酵液的物理性质间接影响产 物的合成。
例如：氧的溶解度和基质的传质速率以及菌对 养分的分解和吸收速率受温度影响。
例如： 青霉菌生长的E=34kJ／mol，呼吸的活化能
E=116 kJ／mol，青霉素合成的E=112 kJ／mol。 这些说明，青霉素合成速率对温度特别敏感：
温度也影响细胞的得率：
细胞得率随温度升高而降低，原因是维持生命活 动的能量需求增加。
维持系数的活化能为50～70 kJ／mol，最大的转 化率所处的温度一般略低于最适生长温度。
死亡率增加。
活化能高低的意义：
微生物生长活化能Ea在50～70kJ／mol，死亡活化能 Ea’为300-~380kJ／mol。
这说明死亡速率随温度增加的速度远大于生长速率。
4.61lg K r2
E
K r1
11
T1 T2
式中 Kr1、Kr2分别为在 温度T1、T2下酶的活力。
此外，活化能E反映酶反应速率受温度变化的影响程度:
特别是葡萄糖，不宜同其他养分一起灭菌。
举 例：
培养基灭菌条件对葡萄糖氧化酶的产生有显著影响。灭 菌温度比灭菌时间对产酶的影响更大。
三、 种子质量
种子的质和量影响： 发酵期间菌种生长的快慢。 产物合成的多寡。
1、 种龄
一般，种龄是对数生长期的后期。
太年轻的种子接种后会出现前期生长缓慢，整个发酵 周期延长，产物开始形成时间推迟。
Arrennius方程式：
温度对比生长速率与比死亡速率的影响可用 Arrennius方程式表示：
1nμ=lnA－Ea／RT (7-32) 1na =lnA’－Ea’／RT (7-33) 式中：A和Ea分别为Arrennius常数和活化能；R和T 分别为通用气体常数和绝对温度。
若在半对数坐标纸上作最大比生长速率lnμm对温度 T的倒数作曲线，曲线的弯曲部分的温度大于最适温度。
例2：谷氨酸发酵中以乙醇为碳源，控制乙醇浓度在 2.5～3.5g/L，可延长谷氨酸合成时间。
例3：葡萄糖氧化酶(GOD)发酵中，葡萄糖对GOD的形 成具有双重作用，低浓度下有诱导作用；高浓度会起分解代 谢物阻遏作用。葡萄糖的代谢中间产物对GOD有明显的抑 制作用。
二、 灭菌情况
一般随灭菌温度升高，时间延长，对养分的破坏作 用愈大，从而影响产物的合成。
化学工程和计算机的应用为发酵工艺控制打下基础。
研究发酵动力学，找出能适当描述和真正反映系统 的发酵过程的数学模型，并通过现代化的试验手段和计 算机的应用，定能为发酵的优化控制开创一个新的局面。
一、基质浓度对发酵的影响及其控制
培养基配方被视为公司机密。这说明其重要性。
建立高产经济发酵过程的关键支撑因素： a. 先进的培养基组成 b. 先进的细胞代谢物分析技术 c. 先进的统计优化策略 d. 先进的生化研究
大多数微生物生长适应的pH跨度为3~4，其最佳生 长pH跨度在0.5~1。
不同微生物生长pH最适范围不一样，细菌和放线菌 在6.5~7.5，酵母在4～5，霉菌在5~7。其所能忍受的pH 上下限分别为：5～8.5，3.5~7.5和3～8.5；但也有例外。
pH影响跨膜pH梯度，从而影响膜的通透性。
பைடு நூலகம்
微生物的最适pH和温度之间似乎有这样的规律：
生长最适温度高的菌种，其最适pH也相应高一些。 这一规律对设计微生物生长的环境有实际意义，如控 制杂菌的生长。
微生物生长和产物合成阶段的最适pH通常是不一样的：
这与菌种特性有关，也与产物化学性质有关。 举例：各种抗生素生物合成的最适pH如下：链霉素和 红霉素为中性偏碱，6.8～7.3；金霉素、四环素为5.9~6.3； 青霉素为6.5~6.8；柠檬酸为3.5~4.0。
过老的种子虽然菌量较多，但会导致生产能力下降， 菌体过早自溶。
不同品种、不同工艺条件的发酵，最适种龄也不尽相 同，要经多次试验而定。
2、 接种量 常用接种量为5％～10％；抗生素发酵有时增加到20
％～25％，甚至更大。 接种量是由菌的生长繁殖速度决定的。
较大接种量的优点： 缩短生长达到高峰的时间，使产物合成提前。原因：
温度影响细胞代谢过程和生物大分子的组分：
例1： μ随T上升而增大，胞内RNA和蛋白质的比例也随着
增长。这说明为支持高的生长速率，细胞需要增加RNA 和蛋白质的合成。
重组蛋白的生产，曾用温度从30℃更改为42℃来诱 导产物蛋白的形成。
例2：
温度降低，细胞脂质不饱和脂肪酸含量增加。因膜的 功能取决于膜中脂质组分的流动性，而后者又取决于脂肪 酸的饱和程度。
试验结果表明，生长期和 生 产 期 的 pH 分 别 维 持 在 6.5 和 7.0可使利福霉素B的产率比整 个 发 酵 过 程 的 pH 维 持 在 7.0 的 情况下的产率提高14％。
3、 pH的控制
控制pH在合适范围应首先从基础培养基的配方考 虑，然后通过加酸碱或中间补料来控制。如在基础培养 基中加适量的CaCO3。
发酵过程中pH的变化与微生物的活动有关 ：
NH3在溶液中NH4+的形式存在，被利用成为R—NH3+ 后 ， 在 培 养 基 内 生 成 H+ ； 如 以 N03- 为 氮 源 ， H+ 被 消 耗 ， N03-还原为R—NH3+；如以氨基酸作为氮源，被利用后产 生的H+，使pH下降。
pH改变的另一个原因是有机酸的积累，如乳酸、丙 酮酸或乙酸。
菌生长的最适温度与产物合成最适温度不一定一致， 因此发酵过程应该变温控制。
例1：
黄原胶发酵前期的生长温度控制低一些，27℃；中 后期控制在32℃，可加速前期的生长和明显提高产胶量 约20％。
在22℃和33℃的黄原胶得率分别为54％和90％。 黄原胶比形成速率随温度而增加。黄原胶中的丙酮酸 含 量 随 温 度 变 化 在 1.9 ％ ～ 4.5 ％ 之 间 ， 最 高 出 现 在 27~30℃。