碱性磷酸酶米氏常数的测定

碱性磷酸酶米氏常数的测定

[目的与要求]

通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。

[原理]

在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。

V = V max[S]/(K m+[S])

上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。

K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。

酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：

1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max

此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成

一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。

图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。

可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：

[操作步骤]

1．底物浓度对酶促反应速度的影响

（1）取6支试管，作好标记。按下表操作。

试剂（mL）管号

1 2 3 4 5 6

0.04mol/L 基质液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0

pH10，0.1mol/L碳酸盐缓冲液 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70

蒸馏水 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20

37℃水浴中保温5分钟

血清 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10

最终基质浓度 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00

(2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15 分钟。

(3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。

(4)各管分别加入0.3％ 4-氨基安替比林1.OmL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。

(5)以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/V作纵坐标，作图求出K m值。

2. 酚标准曲线的绘制

（1）取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。

试剂（mL） 1 2 3 4 5 6

0.1mg/mL 酚标准溶液 0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40

蒸馏水 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60

37℃水浴保温5min

碱性溶液 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10

0.3% 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.5% 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

(2)混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。

(3)以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。

[结果与计算]

在37℃保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量(μg)即可算出酶活性。

100mL血清中酶活性 = 释放的酚量×（1/0.1）×100×（1/1000）

[注意事项]

1．血清取量要准确

2．标准曲线必须是过原点的一条直线

[试剂]

1．0.04mol/L 基质液称取磷酸苯二钠10.16g或无水磷酸苯二钠8.72g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，并定容至1000mL，加入4mL氯仿防腐，置棕色瓶中，冰箱内保存可用一周。

2．0.1mol／L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

3．碱性溶液取0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaHC03各20mL，混合后加蒸馏水到100mL。

4．0.5％铁氰化钾取铁氰化钾5g和硼酸15g各溶于400mL蒸馏水中，溶解后二液混合，再加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶中，暗处保存。

5．0.3％ 4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及NaHC034.2g用蒸馏水溶解，并稀释至100mL，置棕色瓶中，4℃保存。

6．酚标准液(0.1mg/mL)

a．称取结晶酚1.50g，溶于0.1mol／L HCl，定容至1000mL为贮备液。

b标定：取25mL上述贮备液，加0.1mol／L NaOH 55mL，加热至65℃。再加入0.1mol/L 碘液25.0mL，盖好放置30分钟，加浓HCl 5mL，再以0.1％淀粉作指示剂，用0.1mol／L 硫代硫酸钠滴定，反应如下：

3I2 + C6H5OH C6H2I3OH + 3HI

I2 +2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

根据反应，3分子碘(Mw：254)与一分子酚(Mw：94)起作用，因此每毫升0.1mol/L碘液(含碘12.7mg)相当于酚的毫克数为 12.7×94/（3×254）=1.567

25mL碘液中被硫代硫酸钠滴定者为xmL，则25mL酚溶液中所含酚量为：1.567mg×（25-x）。

c. 应用时，按标定结果用蒸馏水稀释至0.1mg／mL作为标准液。

[器材]

1．37℃水浴 2．可见光分光光度计