从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成,为结合酶,等电点为6.2)的技术路线(
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• 材料的选择
技 • 材料的预处理 术 • 酶的提取 路 • 酶的分离 线 • 酶的纯化
• 酶纯度的检验
2020/4/24
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4.2.1材料的选择
• 因动物肝脏中的酶往往结合较多的 脂质、核酸的物质，所以取饥饿 24小时的动物肝脏为实验材料。
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4.2.2 材料的预处理
• 细胞破碎：机械破碎法。可选用捣碎法或匀浆 法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞 团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。
• 防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入 蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有 苯甲基磺酰氟（PMSF ）、二异丙基氟磷酸； 金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA （乙二醇 四乙酸）
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
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4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
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4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
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请老师和同学们批评指正！
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• 纯化：Sevagr法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、 盐酸法、酶法、有机溶剂混合法除去蛋白质。用透 析法、柱离子交换法和纤维滤器透析法去离子。
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4.2设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一 种 酶（该酶由三种不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2） 的技术路线并理解实验各步骤的原理
• 先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织液1:20的量和氯仿 /甲醇一起组织匀浆，分层后在室温下在摇床中摇动15到 20分钟
• 匀浆通过滤纸过滤或者离心获得液体
Fra Baidu bibliotek
• 在离心获得的液体中加入0.2倍体积（4ml）的水或者 0.9%的生理盐水涡旋几秒钟后混匀，然后2000rpm离心 得到两相溶液，通过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类的分 析和有机小的极性分子的分析，如果需要的话用甲醇/水 （1/1）的溶液将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让 甲醇/水与下层混合
• 通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相中含有脂质，如
果体积在2到3ml以下，则通过真空旋转蒸发器或在氮气
下浓缩
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4.1.4糖类的分离纯化
• 提取：动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般 需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液 进行回流脱脂，释放多糖。
• 分离：分级沉淀法、金属络合物法、制备性区域电 泳、色谱分离法和膜分离法。其中分级沉淀法主要 有有机溶剂分步沉淀法、盐析法及季铵盐沉淀法； 色谱分离法分为凝胶柱色谱和离子交换色谱法；膜 分离法主要有超滤和微滤法。
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4.1.2核酸的分离纯化——RNA
前四步与DNA的分离纯化方法相同，之后可 通过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理 除去DNA。可再利用柱层析、梯度离心及逆 流分溶等方法提取所需种类RNA。
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4.1.3脂质的分离纯化
• 利用Folch Method从组织中分离和纯化脂质
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
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4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
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2.主要内容
• 自主设计从生物样品中分离纯化生物大分 子的技术路线
• 设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯 化和鉴定一种酶的技术路线并理解实验各 步骤的原理
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3.研究方法和手段
• 研究方法：文献研究法——搜集整理相关研究资 料为研究做准备
• 研究手段：以传统文献检索手段为主，辅以网络、 数据库等手段，开展资料、搜集数据整理等工作
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4.3.5酶的纯化
• 结晶：盐析结晶法——加固体盐法、饱和盐溶液、 透析扩散法。
• 浓缩：真空蒸发浓缩——在一定的真空条件下，使 酶液在60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一 般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 降低压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
• 干燥：真空干燥法——真空干燥是在与真空系统相 连接的密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶 液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵 之前需要设置水蒸气凝结收集器，以免汽化产生的 水蒸气进入真空泵。酶液真空干燥的温度一般控制 在60℃以下。
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4.文献综述
生物大分子的分类：蛋白质、核酸、脂质、糖类 接下来分类讲解如何从生物样品中分离纯化以上四 类生物大分子的技术路线
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4.1.1蛋白质的分离纯化
• 分离方法：透析超滤除蛋白质溶液中的小 分子化合物
• 浓缩方法：丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀 • 纯化方法：电泳、层析
生物大分子的分离纯化和 特定酶分离纯化技术路线的设计
16级长学制临床三班 范佳祺 常钰涵 赵瑾 冯璞
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目录
1.研究目的 2.主要内容 3.研究方法和手段 4.文献综述 5.工作进度安排 6.预期成果
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1.研究目的
• 锻炼自主学习和查阅文献的能力 • 锻炼设计实验的能力
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技 • 材料的预处理 术 • 酶的提取 路 • 酶的分离 线 • 酶的纯化
• 酶纯度的检验
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4.2.1材料的选择
• 因动物肝脏中的酶往往结合较多的 脂质、核酸的物质，所以取饥饿 24小时的动物肝脏为实验材料。
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4.2.2 材料的预处理
• 细胞破碎：机械破碎法。可选用捣碎法或匀浆 法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞 团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。
• 防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入 蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有 苯甲基磺酰氟（PMSF ）、二异丙基氟磷酸； 金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA （乙二醇 四乙酸）
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
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4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
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4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
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请老师和同学们批评指正！
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• 纯化：Sevagr法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、 盐酸法、酶法、有机溶剂混合法除去蛋白质。用透 析法、柱离子交换法和纤维滤器透析法去离子。
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4.2设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一 种 酶（该酶由三种不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2） 的技术路线并理解实验各步骤的原理
• 先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织液1:20的量和氯仿 /甲醇一起组织匀浆，分层后在室温下在摇床中摇动15到 20分钟
• 匀浆通过滤纸过滤或者离心获得液体
Fra Baidu bibliotek
• 在离心获得的液体中加入0.2倍体积（4ml）的水或者 0.9%的生理盐水涡旋几秒钟后混匀，然后2000rpm离心 得到两相溶液，通过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类的分 析和有机小的极性分子的分析，如果需要的话用甲醇/水 （1/1）的溶液将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让 甲醇/水与下层混合
• 通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相中含有脂质，如
果体积在2到3ml以下，则通过真空旋转蒸发器或在氮气
下浓缩
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4.1.4糖类的分离纯化
• 提取：动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般 需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液 进行回流脱脂，释放多糖。
• 分离：分级沉淀法、金属络合物法、制备性区域电 泳、色谱分离法和膜分离法。其中分级沉淀法主要 有有机溶剂分步沉淀法、盐析法及季铵盐沉淀法； 色谱分离法分为凝胶柱色谱和离子交换色谱法；膜 分离法主要有超滤和微滤法。
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4.1.2核酸的分离纯化——RNA
前四步与DNA的分离纯化方法相同，之后可 通过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理 除去DNA。可再利用柱层析、梯度离心及逆 流分溶等方法提取所需种类RNA。
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4.1.3脂质的分离纯化
• 利用Folch Method从组织中分离和纯化脂质
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
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4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
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2.主要内容
• 自主设计从生物样品中分离纯化生物大分 子的技术路线
• 设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯 化和鉴定一种酶的技术路线并理解实验各 步骤的原理
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3.研究方法和手段
• 研究方法：文献研究法——搜集整理相关研究资 料为研究做准备
• 研究手段：以传统文献检索手段为主，辅以网络、 数据库等手段，开展资料、搜集数据整理等工作
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4.3.5酶的纯化
• 结晶：盐析结晶法——加固体盐法、饱和盐溶液、 透析扩散法。
• 浓缩：真空蒸发浓缩——在一定的真空条件下，使 酶液在60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一 般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 降低压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
• 干燥：真空干燥法——真空干燥是在与真空系统相 连接的密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶 液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵 之前需要设置水蒸气凝结收集器，以免汽化产生的 水蒸气进入真空泵。酶液真空干燥的温度一般控制 在60℃以下。
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4.文献综述
生物大分子的分类：蛋白质、核酸、脂质、糖类 接下来分类讲解如何从生物样品中分离纯化以上四 类生物大分子的技术路线
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4.1.1蛋白质的分离纯化
• 分离方法：透析超滤除蛋白质溶液中的小 分子化合物
• 浓缩方法：丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀 • 纯化方法：电泳、层析
生物大分子的分离纯化和 特定酶分离纯化技术路线的设计
16级长学制临床三班 范佳祺 常钰涵 赵瑾 冯璞
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目录
1.研究目的 2.主要内容 3.研究方法和手段 4.文献综述 5.工作进度安排 6.预期成果
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1.研究目的
• 锻炼自主学习和查阅文献的能力 • 锻炼设计实验的能力
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