组培实验报告

学号姓名学院专业、班级实验课程名称红豆杉愈伤组织的诱导培养1. 实验设备及材料（1）主要实验用具和仪器冰箱，普通天平，分析天平，各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、电炉，三角瓶，移液管，量筒，烧杯，容量瓶，玻璃棒，医用口杯，精密pH试纸（pH5.4~7.0），药勺，称量纸，标签纸，封口膜，橡皮筋，电炉，高压蒸汽灭菌锅、100ml三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml量筒、10ml和5ml吸管、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒等。

（2）药品和试剂硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA （6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。

MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、愈伤组织继代培养基、75％酒精。

（3）实验材料红豆杉种子处于脱分化进程中的外植体2．实验方法步骤及注意事项I、MS培养基母液和常用试剂的配制（1）培养基的成分目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。

（2）培养基的配制方法配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。

最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。

如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。

另一个是先配制一系列的浓缩贮备液(母液)，贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。

此法较为常用。

（3）MS培养基母液的配制母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液。

此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。

另一种是配成几种不同化合物的混合母液。

此法在大量配制同种培养基时省时省力。

配好的母液应放在试剂瓶中贮存。

在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。

通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。

混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42- 和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。

同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。

①大量元素母液的配制MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 •2H20、MgSO4 •7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。

配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

注意：CaCl2 •2H20最后加入②微量元素母液的配制MS培养基中的微量元素可由MnSO4 •4H2O、ZnSO4 •7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4 •2H2O、CuSO4 •5H2O、CoCl2 •6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见实验原理中微量元素表）。

配制步骤同大量元素。

③有机成分母液的配制MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。

配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

亦可配制成混合母液，配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

④铁盐母液的配制铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8 →定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。

用时每配l L培养基取该溶液5ml。

⑤植物生长调节物质母液的配制对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm （parts per million，即百万分的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数）较为方便，一般配制成0.5mg·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。

⑥其他常用试剂的配制盐酸（lmol·L-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠（lmol·L-1 ）：用固体氢氧化钠配制75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。

母液最好在2～4℃的冰箱中保存。

尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。

贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。

II、红豆杉愈伤组织诱导培养基配制1、药品及用具的准备（1）MS培养基母液的准备配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。

MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。

（2）实验用具的准备将洁净的各种用具如三角瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。

再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol·L-1NaOH、1mol·L-1HCl准备好。

2、培养基的配制步骤（1）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。

（2）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。

（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。

此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。

所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。

最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。

培养基若偏酸时用lmol·L-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1 HCl来调节。

一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。

（4）培养基的分装配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。

试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。

培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。

（5）培养基的灭菌培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。

消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kg·cm-2或0.106 MPa，121℃时保持15～30 min左右即可。

为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。

排净冷空气的办法：（1）可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；（2）也可采用先关闭放气阀，待压力升到0.35kg·cm-2或0.037 MPa，108℃时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。

培养基灭菌时应注意：培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。

当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。

切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。

3、无菌蒸馏水和接种工具准备在250ml培养瓶中加入100ml蒸馏水，封口包扎；分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。

III、红豆杉愈伤组织的诱导（1）红豆杉愈伤组织的诱导①准备工作A. a 接种室的清洁和消毒；b 超净工作台的开机和消毒；c 消毒溶液、无菌水、装材料的容器、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。

B.实验材料的准备：a 准备红豆杉种子作实验材料；b 实验材料的修整、刷洗、冲洗；c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。

②植物材料的表面灭菌A 操作人员洗手消毒B 装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒C 将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净。

D 倒入消毒剂并计时E 到预定时间后倒出消毒液并用无菌水清洗干净。

F 将种子在水中浸泡约2h（2）红豆杉愈伤组织增殖培养基的配制配方：MS基本培养基＋2mg/L NAA＋0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋0.7％琼脂＋3％蔗糖（3）剥取红豆杉种子里的胚放在准备好的固体培养基上IV、竹子愈伤组织的移栽（1）准备工作实验材料的准备：已长根的竹子幼苗，移栽土的准备（2）竹子移栽将准备好的竹子幼苗移种在装有培养土的小盆中，套袋以让小苗逐渐适应环境。