组培实验报告

学号姓名

学院

专业、班级

实验课程名称红豆杉愈伤组织的诱导培养

1. 实验设备及材料

（1）主要实验用具和仪器

冰箱，普通天平，分析天平，各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、电炉，三角瓶，移液管，量筒，烧杯，容量瓶，玻璃棒，医用口杯，精密pH试纸（pH5.4~7.0），药勺，称量纸，标签纸，封口膜，橡皮筋，电炉，高压蒸汽灭菌锅、100ml三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml量筒、10ml和5ml吸管、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒等。

（2）药品和试剂

硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA （6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、愈伤组织继代培养基、75％酒精。（3）实验材料

红豆杉种子

处于脱分化进程中的外植体

2．实验方法步骤及注意事项

I、MS培养基母液和常用试剂的配制

（1）培养基的成分

目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。

（2）培养基的配制方法

配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。

如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：

一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。

另一个是先配制一系列的浓缩贮备液(母液)，贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。

（3）MS培养基母液的配制

母液的配制有两种方法：

一种是配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。

另一种是配成几种不同化合物的混合母液。此法在大量配制同种培养基时省时省力。

配好的母液应放在试剂瓶中贮存。

在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。

通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42- 和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。

①大量元素母液的配制

MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 •2H20、MgSO4 •7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

注意：CaCl2 •2H20最后加入

②微量元素母液的配制

MS培养基中的微量元素可由MnSO4 •4H2O、ZnSO4 •7H2O、H3BO3、KI、

Na2MoO4 •2H2O、CuSO4 •5H2O、CoCl2 •6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见实验原理中微量元素表）。配制步骤同大量元素。

③有机成分母液的配制

MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

亦可配制成混合母液，配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。

④铁盐母液的配制

铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：

确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8 →定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。

用时每配l L培养基取该溶液5ml。

⑤植物生长调节物质母液的配制

对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm （parts per million，即百万分的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数）较为方便，一般配制成0.5mg·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。

⑥其他常用试剂的配制

盐酸（lmol·L-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制

氢氧化钠（lmol·L-1 ）：用固体氢氧化钠配制

75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制

配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。

母液最好在2～4℃的冰箱中保存。尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。

贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。

II、红豆杉愈伤组织诱导培养基配制

1、药品及用具的准备

（1）MS培养基母液的准备

配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。

（2）实验用具的准备

将洁净的各种用具如三角瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH

试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol·L-1NaOH、1mol·L-1HCl准备好。

2、培养基的配制步骤

（1）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。

（2）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。

（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8

由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。培养基若偏酸时用lmol·L-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1 HCl来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。

（4）培养基的分装

配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。

（5）培养基的灭菌

培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kg·cm-2或0.106 MPa，121℃时保持15～30 min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法：（1）可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；（2）也可采用先关闭放气阀，待压力升到0.35kg·cm-2或0.037 MPa，108℃时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。

培养基灭菌时应注意：培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。

3、无菌蒸馏水和接种工具准备

在250ml培养瓶中加入100ml蒸馏水，封口包扎；分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。

III、红豆杉愈伤组织的诱导