测生理指标的方法

实验路线及安排：项目主要在晋西北地区展开区域化试验，供试品种4个，均为当年生扦插苗,每个品种15株，采用完全随机区组设计进行，其中包

括4个处理，3个重复。所测定内容包括12项生理指标在相应部位(根、茎、叶)的年变化规律，并从形态、生理和生物化学方面对其抗寒抗旱性机理进行

研究探讨。

在每个小区分别选健康植株2株，每株取其中上部位叶片1-2片，组成混

合样，编号,带回实验室用一部分样品进行抗旱指标测定,其余样品放入冰箱低

温处理，处理温度为0℃、-10℃，-20℃，然后进行抗寒指标测定,每月采样

一次。根的取样方法为每个小区分别选健康植株10株，挖出其部分根系组成

混合样,处理方法同叶片；茎的取样方法为选健康植株10株，取其上部嫩茎组

成混合样，处理方法同上。2009年10月-2010年3月对所选材料进行人工

低温干旱处理,完成相关实验指标的测定工作。低温处理通过相对电导率及相

关指标评价其抗寒性；干旱处理是通过对所栽品种进行适宜土壤水分、中度干旱、严重干旱条件的人为处理，测定杨树的蒸腾速率和相应指标，评价其抗旱性。

实验方法

一．光合效率、气孔导度、蒸腾速率三项指标用光合仪直接测定；

二．水势（小液流法）

1.取10个干净的试管，分成A组和B组，都贴上0.05mol/L、0.1 mol/L、

0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 6个不同浓度标签，并向这两组试管中分别移

取相应浓度的CaCl

2

溶液4mL。

2.取待测叶子数片，用打孔器在其上均匀打孔，混匀，将其分别装入A组试

管（每支试管装10片），摇匀，滴入一滴相同浓度的甲烯蓝溶液，再摇匀。

3.用干净的毛细移液管，吸取1～2滴蓝色溶液，小心的插入装着相同浓度的

B组试管中部，轻轻的挤出一滴蓝色溶液，观察蓝色液滴流动方向。

按下公式计算植物组织水势：Ψ=-iRTC

式中：Ψ为植物组织水势（MPa）；C为CaCl2溶液的摩尔浓度（mol/L）；R为摩尔气体常数，0.008314MPa·L/mol·K；T为热力学温度（K），即273+t(t为当时摄

氏温度)；I解离常数（CaCl

2

=2.6）

三．叶绿素含量（直接浸提法）

80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。

按下列公式计算样品中叶绿素含量。

C

A =12.72A

663

-2.59A

645

(1)

C

B =22.88A

645

-4.67A

663

(2)

C

T =C

A

+C

B

=A

652

×1000/34.5 (3)在652nm时可一次测出叶绿素总含量

mg/g FW）=(CV

T

/FW×1000)n (4)

以上公式中，C

A 、C

B

、C

A+B

分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度（mg/L）；

FW为鲜重(g)；C：叶绿体色素的浓度；V

T

为提取液总体积(mL)；n为稀释倍数。

四．丙二醛（MDA）含量测定

试剂：

20%三氯乙酸（TCA）溶液：20g三氯乙酸，加水80ml溶解；

0．1%的TCA溶液：取250ul20%TCA稀释至50ml；

0.5%硫代巴比妥酸溶液：0．25g硫代巴比妥酸溶解于50ml20%的TCA中。

1．取植株上一定叶位的叶片，剪成小段，混匀,称取0.3g；

2．放入冰浴的砚钵中，加少许石英砂和2ml0.05mol/LPH为7.8的磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用2-3 ml0.05mol/L磷酸缓冲液分两次冲洗，合并提取液；

3．在提取液中加入5 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀；

4．将试管放入沸水中煮沸10分钟（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），到时间后立即将试管取出并放入冷水浴中；

5．带试管内溶液冷却后，3000g离心15min，取上清液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532nm、600nm、450nm处的吸光度；

6.结果计算:MDA（mmol.g-1FW）=〔6.452*（A652-A600）-0.559*A450〕*Vt/Vs*FW

式中，Vt:提取液总体积（ml），Vs：测定用提取液体积（ml），FW：样品鲜重（g）五．SOD酶活性的测定

1、NBT反应液的制备

（a）配置50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液：A：取NaHPO4·12H2O 8.95g定容于500ml；

B：取KH2PO4 3.4g定容于500ml；（A：B=9：1）

（b）13mmol/l甲硫氨酸：在180ml50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液中加入348mg甲硫氨酸，待完全溶解后加入后面的试剂。

（c）63umol/l硝基四唑蓝（NBT）：在180ml溶液（b）中加入8.4mgNBT；

（d）1．3umol/l核黄素：在（c）中加入1.2ml核黄素母液（0．14g/30ml：0．14g 核黄素加入30ml水中）；

（e）0.1mmol/lEDTA：在（d）中加入6.6mgEDTA。

将上述步骤配置的NBT反应液避光保存。

2、活性测定

(1)酶液提取:同过氧化物酶液的提取

(2)超氧化物歧化酶活性的测定:

取6mlNBT反应液，加入50ul酶液混合均匀，将试管放于荧光灯架上，光强3000lx 照光10min，到时间后关灯，在722分光光度计560nm处测吸光度值，以内装NBT反应液的试管进行光照的作为对照，以内装NBT反应液但置于暗处的作为参比。

(3)超氧化物歧化酶酶活计算：

酶活性= ()

Ack A V

Ack W Vt

E

-⨯

⨯⨯⨯

1

2

Ack：照光对照管在560nm处的吸光度值Ae：样品管的吸光度值

V：酶提取液总体积

Vt：测定时所用的酶液体积

W：提取酶液的材料鲜重

六．PPO酶活性测定