实验三.血浆蛋白结合率的测定

院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠

实验三：血浆蛋白结合率的测定

1、实验目的

测定磺胺嘧啶钠在不同动物体内的血浆蛋白结合率。

2、实验原理

将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。

具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，与经过同样处理的磺胺药标准液比较，用721分光光度计比色法测出组织中和不同时间的血液中磺胺嘧啶浓度。

由于亚硝酸不稳定，在实验中，用三氯醋酸与亚硝酸钠反应制的得。

剩余的过量亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。

3、实验材料

1、实验动物

兔子一只。

2、设备与器械

712分光光度计、管状半透膜（周长5cm，长约12cm）、丝线、广口瓶、移液器。

3、药物与试剂

10%磺胺嘧啶钠注射液

15%三氯醋酸溶液

0.1%亚硝酸钠溶液

0.5%氨基磺酸胺溶液

0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液

磺胺嘧啶钠贮存标准液

磺胺嘧啶钠应用标准液

4、试验方法

1、试剂的制备

0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液：0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存

透析液（PBS）：pH7.4的0.02M 磷酸盐缓冲液，内含0.15M NaCl

磺胺嘧啶钠应用标准液：10%磺胺嘧啶钠注射液3.75μl溶于约80ml3%三氯醋酸溶液再定容于100ml容量瓶中备用

2、血浆制备

兔心脏采血，肝素抗凝，以3000rpm离心10min，取上清液即为血浆。

3、透析

将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端，袋口不得污染血浆。将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面，加0.05mg/ml的磺胺嘧啶钠溶液0.5ml于各瓶袋外透析液中。置广口瓶于冰箱中，平衡透析约60h左右。吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，无浑浊，说明无血浆蛋白漏出。取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。

4、用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度。

取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤，取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管；取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管；取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管，在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min，各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放置2min ，各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混匀，放置10min，用721分光光度计在550nm波长处比色：以空白管校正光密度到0点，读取标准管和测定管光密度，并用公式计算：

测定管光密度

游离磺胺药含量（mg%）= ——————×应用标准液浓度×样品稀释倍数

标准管光密度

5、计算血浆蛋白结合率。

Dt - Df

fb= --------------×100%

Dt

fb：血浆蛋白结合率；

Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）；

Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）

五、实验结果

1、结果记录

计算得：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml

透析袋外药物浓度=0.00039mg/ml

3、药物血浆蛋白结合率的计算结果：

兔：fb=88.9%

六、结果讨论与总结

1、分光光度计的使用操作。

由于应该使用一套比色杯来测定吸光度，而在实际操作中比色杯使用混乱，而且并没有做到严格的润洗，所以吸光度的测量存在较大的误差。

分光光度计的使用应该注意的事项：

（1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

（2）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

（3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

（4）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

（5）在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。

2、总结

动物的种属、生理病理状态、个体差异可以影响血浆蛋白结合率。理论上当蛋白浓度足够高时所有与蛋白作用的药物都能被结合。但实际情况下，当亲和力较低时不可能达到这种所谓的足够高的蛋白浓度。蛋白浓度一定时，一定范围内当药物浓度增加结合的药量会随之增加，但结合分数降低。相反，当药物浓度下降时，结合分数增加并逐渐趋向于一个最大值, ，因此不同药物在低浓度时的最大结合率各不相同。平衡透析法是一种相对简单不需要复杂设备的可行性强的操作方法。

实验过程中所用三角瓶、移液管、试管等并没有经过彻底清洗会对实验结果造成影响，不同的动物种类以及相同的动物的个体差异会对实验结果造成影响，还有操作人员的失误也会对实验结果造成影响，药物浓度和血浆蛋白浓度对结合率都有影响。在报导血浆蛋白结合率时，必须同时注明实验过程中所用的药物浓度和蛋白浓度。