分子生物学实验

实验一.质粒提取与琼脂糖电泳

一、目的

掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。

二、原理

1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具

有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0-

12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的

质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。

2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，

它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

三、实验材料、仪器、试剂

（1）菌种：大肠杆菌DH5α

（2）分子生物学试剂

10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。

50×TAE电泳缓冲液:

24.2g Tris

5.71g 冰乙酸

10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。

6×上样缓冲液:

0.25% 溴酚蓝

40%（W/V）蔗糖水溶液

1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。

(4) 细菌培养基

含抗生素的LB培养液

酵母提取物 5g

蛋白胨 10g

NaCl 10g

琼脂 15～20g

水 1000mL，

必要时，调整至pH 7.4～7.6

将上述培养基

以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。灭菌后的LB培养基可室温保存，使用前加入相应抗生素。含抗生素的LB培养基应放入4O C 冰箱内暂存。

含抗生素的LB琼脂平板

LB培养基中加15 g琼脂，以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。待培养基温度降至40-42O C，加入相应抗生素，摇动培养基，使抗生素与培养基充分混匀。将培养基倒入细菌培养皿，凝固后倒置。6小时后放入4 O C冰箱备用。

（5） Promega EastepTM质粒小提试剂盒

（6）其它准备物品

1mL、100μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mL eppendorf管；试管及试管塞：小型离心机；无水乙醇。

四、实验步骤

（一）大肠杆菌的制备

从新鲜LB琼脂平板（含抗生素）上挑出单个菌落接种于5ml LB培养液中（含相同的抗生素），于37°C摇床培养过夜（12-16小时）。

（二）大肠杆菌的裂解

1.将1-5ml (高拷贝数的质粒)或10ml（低拷贝数的质粒）的细菌培养物于

10,000×g 离心5分钟。弃去上清液，并吸去剩余培养液。

2.加入250μl细胞悬浮液，震荡或吹打以充分混匀细胞。充分混匀细胞非常关键。如果悬浮的细胞不在离心管中，则将其转移至1.5ml无菌离心管中。

注意：以下操作步骤不要震荡以避免切断染色体DNA。

3.加入250μl细胞裂解液，颠倒离心管4次以充分混匀（不要震荡）。室温孵育细胞悬浮液至澄清，孵育时间大约需要1-5分钟。

注意：在加入碱性蛋白酶溶液（第4步）之前观察裂解液是否变为澄清非常重要。但孵育时间不要超过5分钟。

4.加入10μl 碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混匀。于室温孵育5分钟。碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。碱性蛋白酶孵育时间不要超过5分钟，否则质粒DNA会出现缺口。

5.加入350μl 中和溶液并迅速颠倒离心管4 次以充分混匀（不要震荡）。

6.于室温将细胞裂解液以最大速度（约14,000×g）离心10 分钟。取澄清裂解液进行以下步骤的质粒DNA的分离及纯化。

(三) 质粒DNA的纯化

7．准备好微量纯化柱和收集管。一个样品需要一个微量纯化柱和一个收集管，将微量纯化柱插入收集管中。

8．用移液枪将澄清裂解液（大约850μl）转移到准备好的微量纯化柱中，避免碰到沉淀物。

注意：如果转移过程中不小心带入了白色沉淀物，需将微量纯化柱中的内含物重新转移到一个无菌1.5ml离心管中并以最大速度离心5-10分钟。再将离心后的上清液转移至先前使用的微量纯化柱中。微量纯化柱可以重复使用，但仅限于同一样品。

9．于室温，14000×g离心1分钟，将微量纯化柱从收集管上移开，弃去收集管中的液体后重新装回到收集管上。

10．加入750μl柱清洗液（已加95%乙醇）。

11．于室温，14000×g离心1分钟，清空收集管。

12．加入250μl柱清洗液重复清洗步聚（已加95%乙醇）。

13．于室温，14000×g离心2分钟。

14．从收集管上取下微量纯化柱并转移至无菌1.5ml离心管中。操作时需小心，在转移微量纯化柱到离心管中时切勿带入清洗液。如果微量纯化柱上粘有柱清洗液，则需要重新以最大速度离心1 分钟，以甩掉柱清洗液后再转移到离心管中。

15．加入100μl无核酸酶水，于室温，14000×g离心1分钟。

不加缓冲液的DNA水溶液可保存在—20°C或更低的温度下。如果需要将DNA保存于TE缓冲液中，则在100μlDNA中加入11μl 10×TE缓冲液，加了TE缓冲液中的DNA保存在4°C是稳定的。

（四）琼脂糖凝胶电泳

1．将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

2．调整好梳子的高度；

3．称取0.24 g琼脂糖于30 ml 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50o C时加入核酸染料，倒入制胶板中；

4．凝胶凝固后，小心拔去梳子；

5．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，

6．将电泳样品与6X loading buffer 混合后将样品依次加入加样孔中；打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

五、结果分析

电泳检测可看到几条带? 提取EGFP质粒的纯度分析。

六、思考与分析

1．提取质粒分子量如何确定?能通过与核酸分子量Marker比较确定质粒分子量吗? 为什么?