蛋白质表达解读

z：β-半乳糖苷酶 y：通透酶 a：转乙酰基酶
乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负 性调控而实现的： • 大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于 阻遏状态。i基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋 白R。R以四聚体形式Leabharlann Baidu操纵子o结合，阻碍RNA聚合酶 与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。 • R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中 还有极低水平的β-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表 达）。
• 表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解 • 细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热
大肠杆菌表达体系的转录调控
大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达
调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的
调控序列。
乳糖操纵元（lac operon）：
I
CAP P O
调控序列
z
y
a
结构基因
P：启动子 O：操纵子 I：调节基因
标签 • 一个转录终止信号 • 一个分泌信号肽（分泌型）
融合蛋白
融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连 接起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用： • 提高外源蛋白在表达系统中的稳定性 • 增加外源蛋白在表达系统中的表达量 • 增加目的蛋白的溶解性 • 作为抗原的标记蛋白 • 易于外源蛋白的纯化
距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3— -11bp）。 SD序列与16s rRNA3’末端碱基AUUCCUCC互补，控 制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密 码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译 效果。
mRNA5`-------UAAGGAGGU-----AUG 16S rRNA3` -------AUUCCUCCA-------
生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时 间。
蛋白质的生物合成（翻译）
• mRNA起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点 AUG前后的核酸序列
• 遗传密码与tRNA • 蛋白质前体的加工 • 蛋白质的分泌
mRNA的核糖体结合位点
SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5`末端非翻译的前导区内，其起点
调节型强启动子
在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质 表达系统最基本的条件:
• 不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA。
• 强启动子使外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有 害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞 的必要的生理功能。
• 带有表达目的基因的质粒，在几次细胞分裂后会丢失。 • 解决的办法：引入强启动子并控制目的基因在宿主细胞
蛋 白 的 糖 基 化
蛋白质的分泌
不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋 白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出 细胞。分泌性蛋白都有一段信号肽，即在蛋白 质合成过程中N端有一15~36个氨基酸残基的 肽段－－信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达 并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切 除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分 泌要简单得多。
菌利用葡萄糖分解供给能量时，cAMP生成 少，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄 糖可供利用时，cAMP含量就升高，cAMP 与cAMP的受体蛋白 CRP （cAMP receptor protein）结合变为CAP，并以二聚体的方 式与特定的DNA序列结合。
遗传密码与tRNA
除了极个别情况,遗 传密码在所有的有 机体内是相同的,但 是不同的有机体内 不同密码子的使用 程度不同。而这种 不同是由于tRNA在 不同的机体内的丰 度不同。
大肠杆菌
人
蛋白质前体的加工
• N端fMet或Met的切除 • 二硫键的形成 • 特定氨基酸的修饰 • 切除新生肽链中非功能片段 • 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 • 糖基化，磷酸化等等
融合蛋白作为抗原的标记蛋白
C-myc 标记蛋白 V5 标记蛋白
融合蛋白易于外源蛋白的纯化
Amylose树脂
MBP麦芽糖结合蛋白
目的蛋白
10 mM 麦芽糖
MBP
Factor Xa 蛋白酶切割位点
非融合蛋白的纯化
融合蛋白的纯化
原核生物表达系统
原核生物表达系统:大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌 大肠杆菌表达体系的优点： • 积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主
大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3`-端的互补性
AUG前后的核酸序列
真核生物无SD序列，但是有一个Kozak序列， 这个序列影响真核mRNA的起始翻译。这个序列 -3位的A最重要，而且在+4位最好是嘌呤，G是 最优的碱基。
-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 G C C AC C AUGG
林政
• mRNA的生物合成 • 蛋白质生物合成 • 原核生物表达系统 • 真核生物表达系统 • 蛋白质的纯化方法
mRNA的生物合成 (转录)
• 目的基因 • RNA聚合酶 • 启动子 • 转录终止信号 • 转录因子等等
启动子
• 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异 结合的部位。 某个基因是否表达决定于特 定的启动子的起始转录。
菌和相应的载体可供选择应用 • 易于进行遗传操作和高效表达 • 操作安全，致病能力低 • 生长迅速，培养代谢易于控制，成本相对低等等
大肠杆菌表达体系的缺点
• 缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达 真核生物的蛋白
• 缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构, 常形成不溶性包涵体 (inclusion body)
• 异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏 蛋白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导lac操 纵元的开放，但本身不受β-半乳糖苷酶的催化分解 而十分稳定。
CAP(cAMP activated protein)的正调控 • cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细
一些信号肽的一级结构
蛋 白 的 分 泌 （ 一 ）
蛋白的分泌（二）
革 兰 氏 阳 性 菌 蛋 白 的 分 泌
革 兰 氏 阴 性 菌 蛋 白 的 分 泌
表达载体
理想的表达载体质粒包括： • 一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位
点 • 一个调节型的强启动子 • 一个选择性标记 • 一个复制起点 • 一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白