全长cDNA文库的构建—SMART技术
利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库
约为 12 c 随机挑取部分克隆进行 测序 , .l. b 并进行生 物信 息学分析 ,75 的序列 烟草 已有 报道 , .% 为烟草 未报道 的基 3 .% 6 5 2 因 ,58 4 .%是未知功 能的基 因 , 明所构建文 库达到了用于 目的基 因分离筛选 和新基 因克隆的建库要求 . 表
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11 主要试剂 胶 回收试剂盒 和质粒提取试剂盒购 于博 日科技有 限公 司. r e Sr t .. 2 P m r c p 逆转录酶 , i i R ae ni t , fI,x N s I b o S E ,N P D 2 0 和 D 10 0 h ir i d T 、 L0 0 L50 分子标准等购 自大连宝生物公司( A A A , T K R ) 连
关键词 :烟草 ; ;S: A 文章编 号 :6 15 7 (0 2 0 -0 30 17 - 0 2 1 ) 10 5 -5 4
Co sr cin o b c o se I 1 e gh d) i r r t n tu t ft a c tm f l 1n t NA l a y wi S o o I. b h
k o n fn t ng n s h er ut s o a tecn t c dl r ys o db u l e r h q i m n f o iga dsre n n w c o e e.T s s h w t t h s u t b a u eq a f f e u r e t r ln e n g u i  ̄l h o r e i r hl id o t r e i e c n n c T技术 [ 的一种 以采收叶片为主的重要经济作物[ , 7 因此叶片是 主要的研究对象. ] 目前 , 对烟草茎提取物 质已有研究. 如王家隆 研究发现 , 烟草茎秆 含有极 为丰富的糖分、 白质 、 肪、 蛋 脂 无氮浸 出物等 营养物 质, 可以作为饲料 ; 岑小惜等 研究发现 , 烟草茎秆经浸渍法粗提取后含有石油醚、 乙醇、 苯、 丙酮 等成分 ,
【推荐下载】SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建
SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建 【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。
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SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建 作者:朱碧云,高蓝,黄欣,李浩明 【摘要】目的构建红曲霉cDNA文库,为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。
方法采用SMART(switching mechanism at 5 end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库,经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率,PCR测定插入片断的大小。
结果原始文库的库容为2.03 105,重组率达94%。
插入片段大小多在0.7~2.0 kb,平均大小在1 kb左右。
结论所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。
【关键词】红曲霉菌cDNA文库SMART Abstract:Objective Construction of Monascus cDNA Library provide foundations for the research of Monascus functional genes and screening,cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in Monascus.Methods A cDNA library was constructed based on SMART system. The number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment was determined by PCR. Results The primary library capacity was 2.03 105,average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. Conclusion The library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins. Key words: Monascus; cDNA Library; SMART 红曲霉菌(Monascus)是我国重要的微生物资源,其应用已有上千年的历史。
铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析
铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的:为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。
方法:以SMART(switching mechanism at 5′ end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。
结果:该文库重组率为93.9%,文库滴度1.3×106 cfu·mL-1,插入片段平均大小1.5 kb 左右。
随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序,通过生物信息学分析,获得150个单一序列,其中147个序列与相应的同源蛋白匹配,GO(gene ontology)分类表明这些序列参与各种生化途径。
8个序列包含了完整编码框,可判断为全长基因。
结论:成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库,为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。
标签:铁皮石斛;均一化;cDNA 文库;序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物,具有独特的药用价值,为我国名贵中药材。
铁皮石斛以其茎入药,其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素,有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效,主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。
铁皮石斛种子小无胚乳,自身繁殖力低,在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,加上人为的过度采挖,其自然资源濒临枯竭[2]。
近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3],使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。
由于对天然药物需求的不断增加,解决药物资源匮乏问题一直存在,从20世纪90 年代开始,药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。
通过确定药用植物的功能基因,发展药用植物的基因工程,获取药用植物的药用成分,这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。
利用SMART技术构建新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库
利用SMART技术构建新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库吴茜;田可川;刘武军;张艳花;吴伟伟;徐新明;张廷虎;马晓燕;黄锡霞【期刊名称】《西北农林科技大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2010(038)005【摘要】[目的]探寻控制羊毛性状的相关基因,构建了新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库.[方法]采用Clontech公司的CreaterTM SMARTTM cDNA library construction kit,用Biozol试剂提取新吉细毛羊皮肤组织总RNA后,以反转录酶SuperscriptTM Ⅱ反转录为第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA,扩增产物经纯化、Sfi Ⅰ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到Sfi Ⅰ消化过的pDNR-LIB(带有Sfi Ⅰ A和B 2个位点)质粒载体中,最后用热击转化法将重组质粒转化到E.coli DH5a内,得到新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA 原始文库,扩增后的文库分装后用50 mL离心管保存.[结果]构建的cDNA文库约含4.2×105个独立克隆,重组效率为100%,插入片段多为0.5~3.0 kb,平均插入片段长度为1.3 kb,符合建库要求.[结论]经检测所构建的文库库容量满足基因筛选要求,可用于特异表达基因全长序列.【总页数】6页(P46-50,55)【作者】吴茜;田可川;刘武军;张艳花;吴伟伟;徐新明;张廷虎;马晓燕;黄锡霞【作者单位】新疆农业大学,动物科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆畜牧科学院,新疆,乌鲁木齐,830000;新疆农业大学,动物科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆畜牧科学院,新疆,乌鲁木齐,830000;新疆畜牧科学院,新疆,乌鲁木齐,830000;新疆畜牧科学院,新疆,乌鲁木齐,830000;新疆畜牧科学院,新疆,乌鲁木齐,830000;新疆农业大学,动物科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,动物科学学院,新疆,乌鲁木齐,830052【正文语种】中文【中图分类】S826.8+9【相关文献】1.利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库 [J], 蔡铁城;曾建斌;陈顺辉;陈华;贺小彦;张冲;庄伟建2.利用SMART技术构建珙桐叶片全长cDNA文库 [J], 徐刚标;房学爽;叶翠层3.利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库 [J], 韩瑜;强维亚4.利用DSN和SMARTTM技术构建金龟子绿僵菌产孢时期均一化全长cDNA文库 [J], 张石柱;王中康;彭国雄;曹月青;殷幼平;谢磊;刘静;夏玉先5.利用SMART技术构建羊驼皮肤全长cDNA文库 [J], 赫晓燕;范瑞文;张俊珍;程志学;李鹏飞;白瑞;董常生因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
菰均一化全长cDNA 文库的构建
菰均一化全长cDNA 文库的构建作者:臧剑颜育民张志刚邹世湘彭琼来源:《湖南农业科学》2017年第04期摘要:为了获得国家二级保护植物品种菰的功能基因信息,并克隆功能基因片段,研究以SMART(switching mechanism at 5 end of RNA transcript)方式合成菰全长cDNA,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建菰叶片组织的均一化全长cDNA文库。
该cDNA文库库容量大,达到了3.6×106 PFU/mL,插入片段平均长度为1 000 bp,重组率为97.9%。
均一化全长cDNA文库能有效富集低丰度表达基因,降低冗余率,适用于目的基因的筛选,以及后续的基因、蛋白互作分析。
关键词:菰;均一化;cDNA文库;功能基因中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1006-060X(2017)04-0011-03Establishment of a Normalized Full-Length cDNA Library of Zizania latifoliaZANG Jian1,YAN Yu-min2,ZHANG Zhi-gang2,ZOU Shi-xiang3,PENG Qiong4(1. Guangdong Gudao Agricultural Limited Company, Guangzhou 511400, PRC; 2. Hunan Hybrid Rice Research Center,Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Wangxianglong Agricultural Limited Company,Changsha 410125, PRC;4. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center, Changsha 410125, PRC)Abstract:In order to obtain functional genes, a narmalized stems cDNA library was constructed from precious plant Zizania latifolia (Griseb.) Stapf. SMART (switching mechanism at 5 end of RNA transcript) cDNA synthesis combined with DSN (duplex-specific, nuclease)normalization was applied to construct the normalized full-length cDNA library of Z. latifolia. The titer of cDNA library was about 3.6×106 PFU/mL and the average insertion size was about 1.0 kb with high recombination rate (97.9%). Homogenization full-length cDNA library enrichment of low abundance is suitable for the purpose of gene selection and subsequent analysis of the gene and protein interactions, for expressing genes effectively and reducing the redundancy rate.Key words:Zizania latifolia; normalization; cDNA library; functional gene菰(Zizania latifolia (Griseb.) Stapf)即茭白,为多年水生禾本科植物,国家二级保护植物品种,也是水稻的近缘属。
利用SMART技术构建蓝狐脾脏cDNA文库
Ab ta t To a RNA wa x r ce r m Alp x lg pu p e nu i gT io a e t A f l l n t DNA l rr sr c : tl se t tdfo a o e o ss le s a n rz 1 e g n . u l e g h c r i a ywa o s u t du i g b sc n t ce sn r
s r e i ga dc o i gn w a d s e i cg n so le . ce n n n l n n e n p cf i e e f p e n s
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SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库
SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库【摘要】目的构建红曲霉cDNA文库,为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。
方法采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库,经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率,PCR测定插入片断的大小。
结果原始文库的库容为2.03×105,重组率达94%。
插入片段大小多在0.7~2.0 kb,平均大小在1 kb左右。
结论所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。
【关键词】红曲霉菌 cDNA文库 SMARTAbstract:Objective Construction of Monascus cDNA Library provide foundations for the research of Monascus functional genes and screening,cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in Monascus.Methods A cDNA library was constructed based on SMART system. The number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment was determined by PCR. Results The primary library capacity was 2.03×105,average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. Conclusion The library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins.Key words: Monascus; cDNA Library; SMART红曲霉菌(Monascus)是我国重要的微生物资源,其应用已有上千年的历史。
cDNA文库构建知识
全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程,因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A,这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同,如何获得全长的cDNA,如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA(即RACE),曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头,利用已知的接头序列再进行扩增,或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C(或者A/T),再通过补齐粘末端,利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题,比如接头的连接效率非常有限,会导致部分信息的丢失,再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品,需要经过反复的纯化,会损失很多有用的信息,特别是少量样品中的低丰度信息,很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解,很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA,还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART),原理实际上非常简单:在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo(dG)的SMART引物,由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA,在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”,即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC),SMART引物的Oligo (dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板,逆转录酶会自动转换模板,以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端,这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列,合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用
过 mR NA 翻译 而 来 , 因此研 究 mR NA 是 了解 生 物 最为 严重 的柔嫩 艾 美耳 球 虫 ( mei eel ) 基 Ei ratn l 全 a 因组 测序工 作 尚未 完 成 , 因数 据 的 缺 乏严 重 影 响 基 了鸡 球虫病 综合 防控 技术策 略 的发 展 。 国内 已先 后 有 3个 研 究 团 队 构 建 了 E.tn l 的 c eel a DNA 文
的估 计 , 损 失 应 不 小 于 2 其 5亿 元 ( 民 币 ) 如 按 体 生命 活动 的 最好 途 径 之 一 。 目前 , 养 鸡 业 危 害 人 ( 对
平 均年损 失 可达 约 4 2亿 英 镑 ) 目前 鸡 球 虫 病 的 . 。
控 制主要 是依 靠 抗 球 虫药 物 , 以及 活 卵 囊 疫 苗 的 配
全长 基 因 。因此 , 我们 采 用 S MAR T技 术构 建 了 E . 囊 疫苗存 在诸 如有 潜在散 毒危 险 、 以保存 运 输 、 难 生 tnla裂 殖 子 的 c NA 文 库 , 期 能 够 根 据 E eel D 以 . 产 成本 高 等 明显 缺 点 [ 。因此 , 3 ] 生产 实 际 迫 切 需 要 tnl eel a特异 性 E T( 达 序 列 标 签 ) 到其 对应 的 S 表 找 新 的抗 球虫 药物或 者新 型疫 苗面 市 。 全 长序 列 , 隆 出感 兴趣 的 E.t el 克 e l n a相关 基 因 , 从 抗球 虫 药物 和 疫 苗研 制 缓 慢 的主 要 原 因 是 , 至 今 对抗 球虫 药 物 的抗 性 机理 的产 生 、 虫 疫 苗 候 选 球
中 图 分 类 号 :8 2 73 ¥ 5 . 2 文献标识码 : A 文 章 编 号 :0 75 3 (0 2 0—0 60 10 —0 82 1 )40 2—5
全长cDNA文库的构建方法
全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤,它能够捕获一个生物体所有的转录本,为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。
下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。
样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。
这些样本可以是新鲜或冷冻的,只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。
对于一些需要特殊处理的样本,如动物组织,需要按照相关法规进行采集和处理。
RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。
常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。
这些方法能够有效地分离出RNA,并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。
在提取RNA后,需要对其质量和浓度进行检测,以确保其适用于后续步骤。
反转录将RNA进行反转录,生成cDNA,是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。
常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。
oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾,能够捕获mRNA进行反转录。
随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置,也能捕获全长的cRNA。
在反转录完成后,需要检测cDNA的浓度和特异性,以确保其适用于后续步骤。
文库构建在得到全长cDNA后,需要将其克隆到载体中,构建成文库。
常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。
这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增,使得文库的规模得以扩大。
在构建文库时,需要确保cDNA的插入率和多样性,以避免后续步骤中的误差。
文库质量检测在构建完全长cDNA文库后,需要对其质量进行检测。
随着生物技术的不断发展,基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。
在此基础上,研究者们开始mRNA转录本的全长序列,即cDNA。
cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。
本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。
全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本,以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。
利用SMART技术构建羊驼皮肤全长cDNA文库
l ℃过夜 孵 育使 其转 入到 载体 中, 重组产 物在 2 ℃下用 入 h g 6 将 2 一p a : D 包装 效率为 1 。p u mL , 0 ( f/ )i rc lu a ie st Sh n Ag iut r lUn vr iy,Ta g Sh n i03 8 ) i u, a x 0 01
Ab ta t sr c :To f d n w e e uc l e o o c l n fiin l n o c n t u t h e e e p e so r f eo l a a s i i e g n sq ik y, c n mial a d e f e ty a d t o s r c eg n x r s in p o i f p c k n n y c t l a b e u n igo r esae c y s q e cn n l g c l , DNA b a y wa o s r c e . t 1 a l r r sc n t u t d To a i RNA se ta t d b io ,o l we y c n t u tn u l wa x r c e y Tr l f l z o d b o s r c i g f l— ln t DNA i r r fa p c k n b M ART e h o o y t e fr ts r n DNA s s n h sz d b e e s r n c i t f l eghc l a y o l a a s i y S b tc n lg :h i ta d c s wa y t e ie y r v r e t a s rp ,o — l we y p o u ig t e s c n ta d a d d u l s r n DNA y LD— P o d b r d cn h e o d s r n n o b e t a d c b CR; h o b e s r n cDNA sd g s e y p o e s t e d u l ta d wa i e t d b r t a e K n f a d t e h i e e t iec a d S i n h n t e d f r n z DNA sio a e yCHROM A f s wa s lt d b API 一 4 0 s m ed DNA st s e r d i t h e — N 0 :o sc wa mn f re n o t ev c t ra 6 o e n g ta d t e s p c a e t - p a ea 2 f r2 h t o sr c h DNA i r r .Th h r c e ia in o t 1 ℃ v r ih n h n wa a k g d i o k n h g t2 ℃ o O c n t u tt ec l ay b ec a at r t z o
利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库
利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库陈华;姜宝杰;张冲;曾建斌;邓烨;庄伟建【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)011【摘要】SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行.经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106 cfu·mL-1,重组率达93.3%,全长率为59%.插入片段大小多在1.0~2.0 kb,所占比例为70%,平均大小在1.1 kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu·mL-1,可用于长期保存.【总页数】5页(P1178-1182)【作者】陈华;姜宝杰;张冲;曾建斌;邓烨;庄伟建【作者单位】福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S565.2【相关文献】1.利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库 [J], 蔡铁城;曾建斌;陈顺辉;陈华;贺小彦;张冲;庄伟建2.利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库 [J], 韩瑜;强维亚3.利用改进的Oligo-capping法构建手掌参全长cDNA文库 [J], 周建平;杨足君;白丽莉;冯娟;李光蓉;邓科君;任正隆4.利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库 [J], 郭晋隆;阙友雄;刘金仙;郑益凤;陈如凯;许莉萍5.利用改进的Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草(Ae.speltoides Tausch)全长cDNA文库 [J], 毛新国;孔秀英;赵光耀;贾继增因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)
操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程,对于初用者,请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。
A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂:1–3 μl RNA 样本(对照反应,使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时,用水补齐至5 μl。
2. 混匀试剂并瞬时离心。
3. 72°C孵育2 min。
冰上冷却2 min。
4. 瞬时短暂离心。
5. 向每管反应中加入以下试剂:2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂,并瞬时离心。
7. 42°C孵育1 hr。
之后的LD PCR(步骤B)操作需在冰上进行。
8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠,68°C孵育30 min,然后进行步骤C。
B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂:2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂,并瞬时离心。
短命植物小拟南芥全长cDNA文库的构建、测序及EST分析
短命植物小拟南芥全长cDNA文库的构建、测序及EST分析引言拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种广泛应用于分子生物学和植物遗传学研究的模式植物。
由于其短生命周期、小型体型和基因组较小等特点,使其成为了许多遗传和生物学研究的理想模型。
本文旨在介绍如何构建和测序短命植物小拟南芥的全长cDNA文库,并利用EST分析得到的结果来揭示其中的基因表达情况。
材料与方法构建全长cDNA文库1. 提取RNA:选择生长期适中的小拟南芥植株,从不同的组织(如叶片、茎、花)分别提取总RNA。
2. 高质量RNA提取:使用三碱基盐法(Trizol)或商用RNA提取试剂盒提取总RNA。
3. 降解DNA:将总RNA处理为DNA-free RNA,利用DNase I去除其中的DNA,以确保所构建的cDNA文库只包含RNA。
4. 合成cDNA:利用逆转录酶(Reverse Transcriptase)和随机引物将DNA-free RNA合成cDNA。
5. 限制性内切酶切割:将合成的cDNA利用限制性内切酶切割,去除其中的连接酶和引物,以获取合适长度的cDNA片段。
6. 连接载体:将切割后的cDNA利用连接酶连接到选定的载体上,形成cDNA文库。
7. 转化宿主细胞:将构建好的文库转化到适当的宿主细胞中。
文库测序与EST分析1. 测序:通过Sanger测序或新一代测序技术对构建好的cDNA文库进行测序,获取测序片段。
2. 质量控制:对测序得到的reads进行质量控制,去除低质量的reads,保留高质量的测序数据。
3. 序列拼接:将测序得到的reads利用拼接软件进行序列拼接,得到更长的EST序列。
4. EST注释:将拼接得到的EST序列与已知基因组序列或数据库中的核酸或蛋白质序列进行比对,以进行基因注释。
5. 基因表达分析:利用EST序列的数量和注释信息,可以对小拟南芥不同组织中的基因表达进行分析。
6. 功能注释:将某些具有重要功能的EST序列与已知基因进行比对,从而了解其所对应的基因功能。
全长cDNA主要构建方法的比较
全长cDNA主要构建方法的比较摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法,分别是SMART法和Cap trapper法。
关键词:全长cDNA构建SMART法Cap trapper法随着测序技术和计算机科学的不断发展,大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。
cDNA作为基因克隆的一种重要工具,在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。
但是,由于传统的cDNA由于反转录能力差,cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。
而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。
目前主要有CAPture法,Oligo capping法,SMART法,Cap jumping法以及Cap trapper 法。
本文主要介绍优点突出的两个方法,SMART法和Cap trapper法。
SMART 方法SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3],该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性,快速、简单地构建全长cDNA 文库。
PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的,丧失了RnaseH 的活性,但保留着野生型聚合酶转移酶的活性,能够长距离的反转录,又可识别mR-NA5’帽子结构。
原始一链合成中,转移酶的活性低,延伸效率低。
用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI(A)、sfiI(B)识别位点的寡聚核苷酸序列。
而截短的一链cDNA,反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构,一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。
文库构建
cDNA基因文库的构建2009-10-11 17:56:18| 分类:||一、cDNA文库的特征和发展:cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板,在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA,反义链),以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链,正义链),得到双链cDNA。
将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板,在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA,然后连接到合适的载体上,并转入宿主细胞。
这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。
1)cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区,不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。
2)cDNA一般较短,平均长度1.5kb左右,多数为100bp至10kb。
3)表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。
4)不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。
二、cDNA文库的构建:1、RNA的分离mRNA是构建cDNA文库的起始材料。
总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA,而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪,平均为2%,mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。
由于mRNA在总RNA中所占比例很小,因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。
通过降低rRNA和tRNA含量,可大大提高筛选到目的基因的可能性。
利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。
1)根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件,用于提取RNA。
2)保持mRNA的完整性,是构建全长cDNA文库的核心。
3)选取合适的提取方法,除完整性外,mRNA还要求纯度高、DNA污染少,最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。
4)RNA定量准确,保存合理。
5)根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。
2、第一链cDNA的合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT),由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。
利用DSN和SMARTTM技术构建绿僵菌产孢时期均一化全长cDNA文库
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(5):884~887*基金项目: 国家自然科学基金 (No.30170630) 和重庆市重点自然科学基金(No.8564)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授, 主要从事病原真菌与寄主昆虫之间相互作用的分子机理研究以及杀虫真菌农药研制。
EMail:<Yuxianxia@>. 收稿日期:20070109 接受日期: 20070315 ·研究论文· 利用 DSN 和 SMART TM技术构建金龟子绿僵菌产孢时期均一化全长cDNA 文库 *张石柱,王中康,彭国雄, 曹月青,殷幼平,谢 磊,刘 静,夏玉先 **(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心, 功能基因及调控技术重庆市重点实验室,重庆 400030) 摘要: 为高效获得与绿僵菌产孢相关的全长 cDNA , 采用 DSN (duplexspecific nuclease ) 均一化技术与 SMARTTM(switching mechanism at 5忆 end of RNA transcript) 建库技术相结合的方法,构建了杀虫真菌金龟子绿僵菌( var.)菌株 CQMa102产孢时期的均一化全长 cDNA 文库。
经检测, 原始文库滴度为2.1伊 10 6 cfu/mL , 库容量超过6伊 10 6。
随机挑取 100个克隆,PCR 方法测得文库重组率大于95%,插入片段平均长度1500bp 。
小规模测序分析表明, 全长基因的比例 超过60%。
对组成性表达基因 3磷酸甘油醛脱氢酶 和微管蛋白 均一化前后丰度检测表明, 其丰度均有大幅度的下降,基本满足节约筛库的要求。
赤子爱胜蚓全长cDNA文库的构建及初步鉴定
赤子爱胜蚓全长cDNA文库的构建及初步鉴定
赤子爱胜蚓全长cDNA文库的构建及初步鉴定
以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为材料,λTriplex2TM为载体,利用SMART技术构建全长cDNA文库,从而筛选全长目的基因并研究其结构和功能.经测定原始文库滴度为1.3×106 pfu/mL,扩增总文库滴度为1.0×108 pfu/mL ,重组率达到99%以上,插入片段长度在1.1 kb左右.该文库的建立为功能性新基因的发现奠定了坚实的基础.
作者:许若丹钟理李继刚张伟柳伟强王志强吴策赵美玲 XU Ruo-dan ZHONG Li LI Ji-gang ZHANG Wei LIU Wei-qiang WANG Zhi-qiang WU Ce ZHAO Mei-ling 作者单位:许若丹,李继刚,张伟,柳伟强,吴策,赵美玲,XU Ruo-dan,LI Ji-gang,ZHANG Wei,LIU Wei-qiang,WU Ce,ZHAO Mei-ling(河北大学,生命科学学院,河北,保定,071002)
钟理,ZHONG Li(河北大学,生命科学学院,河北,保定,071002;University of Kentucky College of Medicine, Lexington, KY 40536, USA)
王志强,WANG Zhi-qiang(中国21世纪议程管理中心,北京,100089)
刊名:河北农业大学学报ISTIC PKU英文刊名:JOURNAL OF AGRICULTURAL UNIVERSITY OF HEBEI 年,卷(期):2006 29(3) 分类号:Q785 关键词:赤子爱胜蚓全长cDNA cDNA文库。
一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法
一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟【期刊名称】《大豆科学》【年(卷),期】2006(25)3【摘要】针对SMART方法中PCR扩增削减了大片段基因所占比例,使文库中很难获得大片段克隆的问题,进行了方法改进。
在原始SMART方法的基础上,以大豆叶片为材料,通过琼脂糖凝胶分级分离技术,将PCR扩增后合成的dscDNA分成3个等级,分别与载体连接、转化,构建相应亚库,每个亚库容量在1.0×10^6左右,重组率接近99%。
改进方法所建文库的平均全长率53.6%,与改进前的(52.2%)相当。
插入片段范围为0.5~3.5kb,最大插入片断长度比改进前的提高1.5kb。
该方法提高了SMART方法中大片段克隆的获得率,为大豆功能基因组学研究提供了保障。
【总页数】5页(P223-227)【关键词】改进的SMART法;扩增后cDNA分级分离;全长cDNA文库;大片段克隆【作者】董志敏;李英慧;张宝石;关荣霞;常汝镇;邱丽娟【作者单位】沈阳农业大学农学院;中国农业科学院作物科学研究所国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S565.1【相关文献】1.利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库 [J], 陈华;姜宝杰;张冲;曾建斌;邓烨;庄伟建2.SMARTer技术构建辣椒黄绿苗突变体叶片全长cDNA文库 [J], 马志虎;孙国胜;张昌伟;杨玉霞;潘跃平3.利用SMART技术构建歪头菜叶片全长cDNA文库 [J], 韩瑜;强维亚4.全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略 [J], 何东苟;余新炳;吴忠道5.成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆 [J], 魏英杰;丁金凤;赵勇;王新日;刘玉清;许有元;熊辉;周严;惠汝太;高润霖;强伯勤因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
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【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术
全长cDNA文库的构建—SMART技术
真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程,因此mRNA 的末端都带有一段Poly A,这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同,如何获得全长的cDNA,如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA(即RACE),曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头,利用已知的接头序列再进行扩增,或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C(或者A/T),再通过补齐粘末端,利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题,比如接头的连接效率非常有限,会导致部分信息的丢失,再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品,需要经过反复的纯化,会损失很多有用的信息,特别是少量样品中的低丰度信息,很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解,很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA,还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART),原理实际上非常简单:在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo(dG)的SMART引物,由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA,在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”,即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC),SMART引物的Oligo(dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板,逆转录酶会自动转换模板,以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端,这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列,合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA,因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性,只要单管,一步即可完成,不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀,或者额外的酶反应,只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA 库,更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度,可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA(RACE),和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。
我们在这里分别介绍几个采用SMART技术的产品:
一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit
这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或者50ng的Total
RNA制备成可大量扩增的cDNA,提供包括SMART引物、CDS引物、PCR引物、合成第一链Buffer、dNTP、DTT、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化cDNA用的纯化柱和对照RNA在内的试剂。
其中CDS引物是含有经过修饰的Oligo(dT)的起始引物,能特异结合在mRNA加Poly A的位置,避免结果有过长的Poly A影响后继的测序或者PCR反应,同时也可以作为PCR的3'引物。
合成的cDNA可以直接进行对数扩增或者线性扩增,可以作为定量PCR 的模板,也可以直接用于Clontech的抑制性消减杂交,构建cDNA文库或者做反向Northern杂交(Virtual Northern Blot),还有用于芯片检测的cDNA 探针制备。
二、SMART cDNA Library Construction Kit
常规的建库需要在合成的cDNA双链两端通过连接加上相同或者不同的adaptor,用相应的酶切后可以插入载体中。
由于连接效率低往往导致低丰度或者是较长的cDNA信息的丢失,使文库偏重高丰度和较短的基因,失去应有的代表性。
在做表达文库时,如果cDNA的两端是同一个酶切位点,由于cDNA 可能按两个不同的方向接入载体,反向接入载体的那些cDNA不能正确表达,因而有50%的可能丢失。
然而用两个不同的Adaptor又会涉及双酶切以及双酶切是否完全的问题,影响产率。
另外由于表达时3个碱基代表一个氨基酸,不同的表达框架会得到不同的产物,因此正向插入一个表达载体的cDNA只有1/3的可能得到正确的产物。
虽然一度有ABC表达载体的解决方法,但是一段DNA 同时插入3个载体的机会是有限的。
利用SMART技术建库,可以得到全长的cDNA文库,也不需要Adaptor的连接。
这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与前面的试剂盒略有不同,分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。
SfiI是一个在真核生物基因组中极为稀少的酶,出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。
SfiI识别序列为GGCCNNNN^NGGCC,中间的5个碱基为任意序列。
因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。
这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切,得到的是两端的粘端不同的cDNA,这样就可以定向插入特定的载体中,不会浪费50%的信息。
这个试剂盒提供的载体也很有特色:lambdaTriplex2载体有特别设计,可以用3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。
这样就保证插入的片断的正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。
三、SMART RACE cDNA Amplification Kit
对于DD-PCR或者SSH、RNA指纹、EST芯片等方法得到DNA片断,要钓全长cDNA,或者用同源序列钓其他物种中的同源基因,3'端的扩增一般都不成问题,难就难在5'端的片断扩增。
利用SMART技术将SMART 引物自动加入cDNA的5'端,不但能避免加接头或者加一串碱基的麻烦,而且能得到全长的cDNA 5'端。
只要少至25个碱基的已知序列即可钓出
全长的cDNA。
四、Altas SMART Probe Amplification Kit
由于DNA芯片上的点多,每个点的样品量很有限,要足够的灵敏度需要有足够多的探针。
当制备探针的样品来源有限时,这个试剂盒就是解决办法之一:利用SMART技术可以将少至1000个细胞来源的RNA制备得到足够的cDNA探针。
得到的探针能代表mRNA原有的丰度,而且操作简单。
五、即将推出的Super SMART PCR Kit能够从少到2ng的Total RNA中制备多达1微克的cDNA!而且制备的探针灵敏度提高10倍、稳定性较原有的试剂提高30%!详细信息请留意生物通快讯。
总之,SMART技术是研究人员利用酶的天然属性,经巧妙设计而成为研究人员进行研究的有力武器。
大自然还有更多的奥妙等待我们去发现。