植物多糖分离纯化工艺研究进展

植物多糖分离纯化工艺研究进展贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，天然药物质量控制中心，贵州贵阳550001植物多糖因具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性和多种药用价值，近年已广泛应用于生命科学等研究领域。

由于植物多糖相关研究受其油脂、蛋白质、色素等杂质影响较大，故除杂质、分离纯化技术是该领域研究开展的重要前提。

本文对近年来植物多糖的脱脂、除蛋白、除色素等分离纯化方法技术的研究现状进行总结，为植物多糖的深入研究与开发提供参考。

Abstract：In recent years，because plant polysaccharides are with anti-tumor，anti-virus，anti-ulcer，anti-oxidation and other unique biological activity，a variety of medicinal values have been frequently applied in the field of life sciences research. However，because plant polysaccharides research is limited by its fat，protein，pigment and other impurities，technology of impurities and separation and purification are important premise of research development in this field. This article mainly summarized the recent research on the methods of impurities，separation and purification of plant polysaccharides，which provided a reference for the further research and development of plant polysaccharides.Keywords：plant polysaccharide；impurity removal；separation and purification；review多糖廣泛存在于动植物中，它通过超过10个糖苷键连接不同或相同的单糖而形成，具有抗肿瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、抗溃疡[4]等活性，近年已广泛应用于生命科学等研究领域。

由于植物多糖相关研究受其油脂、蛋白质、色素等杂质影响较大，故除杂质、分离纯化技术是该领域研究开展的重要前提。

如何高效低损失地除杂质，获得均一的多糖，越来越受到关注。

本文对近年来植物多糖的除杂质、分离纯化方法的研究现状进行综述，为植物多糖的相关研究及进一步开发利用提供参考。

1 多糖除杂质提取后的多糖属粗多糖，常含有油脂、蛋白质、色素、盐等杂质，极大地影响植物多糖结构表征和生物活性分析的后续工作[5-6]，故除杂质对植物多糖研究具有关键作用。

1.1 脱脂植物中含有的少量油脂包裹着多糖使提取液难以渗入原料，阻碍多糖的提取，故在多糖提取之前需要脱脂。

目前主要采用一定量的有机溶剂采用索氏回流提取脱脂，常用的有机溶剂为石油醚、乙醚、乙醇。

张斌等[7]研究了甘蔗渣多糖提取的最佳脱脂工艺，得出最佳脱脂工艺条件为乙醇和乙醚（9∶1），回流时间4 h，料液比（g∶mL）1∶25，获得甘蔗渣多糖的提取率为1.02%。

1.2 除蛋白蛋白质与多糖均属亲水性结构复杂的大分子，在除去蛋白质的同时多糖也有所损失，因此高效低损失除蛋白的方法越来越受关注。

目前，除蛋白的方法主要有Sevage法、三氯乙酸法、酶解法、酶法与化学联用法等。

1.2.1 Sevage法蛋白质在氯仿等有机溶剂中会变性而不溶于水。

将植物多糖水溶液与一定配比的氯仿-正丁醇（或戊醇）溶液以5∶1或4∶1比例混合后，剧烈振摇20～30 min，蛋白质变性生成凝胶状，经离心可除去变性蛋白。

Wang Q Z等[8]采用Sevage 法除费菜多糖的蛋白，向样品中加入Sevage试剂（3∶1），振摇25 min，离心除去蛋白，重复3次，蛋白质去除率和多糖损失率分别为（61.28±0.25）%、（29.16±0.19）%。

优点：Sevage法条件温和、操作简单比较常用。

缺点：需重复多次而比较耗时耗财，也不能用于除脂蛋白[9]。

1.2.2 三氯乙酸法蛋白质分子内部的疏水基团能与三氯乙酸发生作用造成蛋白质变性，相互凝聚沉淀。

在多糖水溶液中加入等体积的5%～10%三氯乙酸，混匀静置过夜，离心除沉淀，重复操作可得到脱蛋白多糖。

崔錾等[10]在冰浴条件下向萝藦果壳多糖溶液中分组加入一定量的三氯乙酸溶液，使三氯乙酸最终浓度为5%、10%、15%，于4 ℃冰箱中过夜，4000 r/min离心15 min，取上清液。

结果显示，三氯乙酸浓度为10%时，脱蛋白效果最佳，除蛋白率为71.55%。

优点：能有效去除蛋白。

缺点：需静置过夜耗时；基于酸水解，在一定程度上水解糖苷键[11]。

1.2.3 酶解法蛋白酶可催化水解蛋白质，能较温和地去除蛋白。

杨斌等[12]比较了三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法对蓝刺头多糖除蛋白效果，综合分析显示优化的木瓜蛋白酶法除蛋白效果最佳，除蛋白率、多糖保留率分别为56.57%，98.12%。

其最佳工艺为酶解温度64 ℃，时间2.6 h，pH 6.0。

特点：作用温和，并能较好地保证多糖的生物活性，且多糖损失率较低[9]。

1.2.4 酶法与化学法联用法酶能较为温和地除蛋白，Sevage法、三氯乙酸法可有效除蛋白，将二者联用的方法也较为常用。

苗慧琴等[13]比较了酶-三氯乙酸法、酶-Sevage法、酶法、三氯乙酸法、Sevage法对山药多糖除蛋白的效果。

结果表明，胰蛋白酶-三氯乙酸法脱蛋白的效果最好，蛋白脱除率为87.25%，多糖保留率为92.48%，其最佳脱蛋白条件为胰蛋白酶用量0.4 mL、酶解时间45 min、酶解pH 7.5、酶解温度37 ℃。

特点：与单独使用酶法和化学法相比效率更高，溶剂处理次数相对减少，试验耗时短，操作简单，降低成本[14]。

1.2.5 其他除了Sevage法、三氯乙酸法、酶法等常用的方法外，还可采用聚酰胺法、高氯酸法、季铵盐等去除植物多糖蛋白质。

Yu X H等[11]比较了Sevage法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法、聚酰胺法除西洋参粗多糖的蛋白。

结果表明，使用三氯乙酸和聚酰胺获得的脱蛋白率分别为91.2%和94.9%。

然而，三氯乙酸法属酸水解，在一定程度上水解糖苷键，会破坏其性质和结构特征。

因此，聚酰胺法更适用于多糖溶液脱蛋白，并且多糖损失率仅为10.86%。

常飞等[15]比较了Sevage 法、三氯乙酸法、Sevage-三氯乙酸法、HClO4法对贵州野生甜藤多糖去蛋白的效果。

结果表明，HClO4法脱蛋白效果最佳，经3次脱蛋白处理后蛋白脱出率为94.78%，多糖损失率为15.14%。

该方法适用于除甜藤植物多糖中的蛋白质，工艺简单，成本低，易于提纯，且对环境友好。

Zhou H L等[16]研究用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）去玉米丝多糖蛋白的最佳条件。

当NaCl 0.010 g、pH 6.0、CTAB体积比为10%、解离时间24 h时，得到最佳脱蛋白率为58.17%，多糖保留率为25.29%，多糖的纯度同时从6.445%提高到20.3%。

1.3 除色素除油脂、蛋白质外，色素也是植物多糖的杂质之一。

蛋白去除后，常用活性炭吸附法、双氧水法、大孔吸附树脂法、离子交换树脂法等除去植物多糖中的色素。

1.3.1 活性炭吸附法活性炭具有多孔结构，其表面含的有氧化物或络合物可以与被吸附的物质发生结合，而具有较强的吸附力。

张丽红等[17]利用活性炭对紫苏叶多糖提取液进行脱色。

当活性炭用量为0.58%（M/V）、pH 6.0、温度50 ℃、时间15 min时，脱色率达99.99%，多糖损失率为5.05%。

优点：操作简单、成本低、应用广泛。

缺点：活性炭在脱色后难滤除。

1.3.2 双氧水法双氧水法是利用氧化性，使有色物质的分子氧化失去原有色素。

秦亚东等[18]比较了粉末活性炭、颗粒活性炭、过氧化氢、次氯酸钠对白芍多糖脱色效果。

过氧化氢脱色效果最好，多糖保留率和脱色率分别为72.26%、82.55%；其最佳脫色条件为65 ℃，3.5 h，pH 9，过氧化氢体积分数20%。

优点：脱色效果较好。

缺点：具有强氧化性，破坏多糖结构而损失多糖。

1.3.3 大孔吸附树脂法大孔吸附树脂具有大孔网状结构和较大的比表面积，可有选择地通过物理性质吸附物质。

杨新河等[19]采用D101树脂对普洱茶多糖同时脱色和除蛋白质，当普洱茶多糖溶液体积为50 mL时，在pH 4、50 ℃、料液质量浓度3.8 mg/mL、树脂用量11 mL的条件下，普洱茶多糖的脱色率为82.33%、脱蛋白率为70.89%。

Yang R等[20]通过大孔树脂从南瓜残渣发酵液中纯化粗多糖。

研究了不同极性、直径和表面积的6种树脂（AB-8、S-8、HpH480、HPD100、X-5和D101）同时脱色和脱蛋白的效果，结果表明S-8最佳，色素和蛋白质的吸附率分别为84.3%和75.9%，多糖的回收率为84.7%；经分析，大多数色素和蛋白质被S-8树脂吸收，也没有降解多糖。

特点：与化学脱色方法相比容易再生，可同时脱色、脱蛋白，且几乎不发生多糖降解。

1.3.4 离子交换树脂法离子交换剂对不同离子有不同的吸附能力和置换能力，可选择性地发挥作用。

Jiang H Y等[21]采用A103S阴离子交换树脂填充的径向流动色谱法（RFC）纯化灵芝多糖，得出样品浓度10 mg/mL、体积100 mL、流速2 mL/min、洗脱流速40 mL/min为最佳纯化条件，脱蛋白率、脱色率和多糖回收率分别为80.35%、88.52%和85.06%。

特点：与传统化学方法和轴向色谱法相比，RFC可在最短的时间内获得粗多糖，快速、有效处理大量的样品。

1.4 脱盐此外，植物多糖还含有无机盐等小分子杂质，经过脱盐工艺可以取得更严格的精制多糖。

目前常用的脱盐法主要有超滤法和透析法。

1.4.1 超滤法超滤膜以膜两侧的压力差为动力，使水及比膜孔径小的小分子通过超滤膜。

王贵金等[22]采用超滤法对盐析后的人参酸性多糖脱盐，分别选择截留分子量为1、3、5、10、30 kD的不同超滤膜包进行脱盐。

洗脱剂为超纯水，超滤进口压力2.5 bar、回流口1.8 bar，蠕动泵转速为10 r/min，期间不断补充洗脱剂。