从动物肝组织中分离、提取、纯化及鉴定一种酶
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从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.浓缩： 2.浓缩： 浓缩
从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤 与膜分离、沉淀分离、 与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、 用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下， 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 以下汽化蒸发 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
10级七年二班 10级七年二班 第五组
材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 核酸的物质，所以取饥饿24 24小时 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。 的动物肝脏为实验材料。
1. 细胞破碎
材料的预处理
机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 捣碎法 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 大块的组织或者细胞团 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物 植物组织细胞的破碎故 微生物和 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故 本实验不采用。 本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均 可。 使用冻融法应注意不能 过高的温度下操作 不能在 的温度下操作， 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作， 以免引起酶的变性失活。 以免引起酶的变性失活。 在冷库中进行， 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎 30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。 30～ s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂 化学试剂有 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； ）；② （甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；② 表面活性剂 Tween、特里顿（Triton） ）；③ （Tween、特里顿（Triton）等）；③ 螯合剂 EDTA：乙二胺四乙酸） 他们都可以增加细胞膜 （EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜 的通透性，是酶容易释放。 的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
从肝脏中分离纯化一种酶
四.酶的分离
1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。
实验步骤：装柱；平衡；上样；洗脱；收集
五.酶的纯化、精制
真空干燥 冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以 下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空， 使冰直接升华为气体，而得到干燥的酶制剂。 冷冻干燥得到的酶质量较高，结构保持完整， 活力损失少，但是成本较高。特别适用于对 热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。 实验步骤：先将酶在-80℃环境下预冻1到2 小时然后把样品置于冷冻干燥剂的干燥箱中， 开始冷冻干燥，时间一般为8到20小时。待冻 干物称酥块状或松散片状即可停止。
实验步骤
取家兔肝脏2g，在冰块中用剪刀剪碎，移 入插在冰块中的匀浆器中，加入生理盐水 10ml进行匀浆，再经32层纱布过滤，得到 匀浆液。
物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。使 用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的 变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂② 表面活 性剂③ 螯合剂等。他们都可以增加细胞膜的通透性，使 酶容易释放。
实验步骤：将盐析操作中的滤液置于烧杯中，一边搅拌，
一边利用ph计测量酸碱度，用盐酸调整ph至6.2.然后倒置离 心管中以6000r/min离心15min弃去上清液，得到目的酶蛋白。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的酶以及其他杂质。可用柱层析法进 行进一步的分离。 将交换剂缓冲液的ph调节到目的酶的PL与杂质蛋白的PL 之间使其中一类蛋白吸附在交换剂或者虑过层析柱从而 达到分离的目的。
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从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
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从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成,为结合酶,等电点为6.2)的技术路线 p
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
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4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
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4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
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请老师和同学们批评指正！
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4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定-精
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核酸提取的主要步骤
• 破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、 碱裂解；酶解（溶菌酶）
• 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子： 酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白 酶处理、高盐洗涤 • 除去其它不需要的核酸分子
• 沉淀核酸RNA。
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核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。
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基因组DNA的提取方法
浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度 不同将二者分离。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （7）将混合液转移至50mL刻度离心管中， 3500r/min离心 10min ，取上清至一个新的50mL刻度离心管。 （8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状 物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min 。 （9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即 为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加 入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研磨 成匀浆液。 （2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心 10min，弃去上清液。 （3）将沉淀转移至50mL离心管中，加入10mL预冷的 0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，充分摇匀后，于 4℃ 2000r/min离心10min，弃去上清液。
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动物肝脏DNA提取和鉴定
整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。
核酸提取过程中的注意事项：
01
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
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保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
03
纯的DNA样品的获得
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
01
02
03
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
肝素的提取与鉴定设计实验报告
肝素的提取与鉴定设计实验报告一、实验目的本实验旨在了解肝素的提取方法和鉴定方法，掌握肝素的提取技术和纯化方法，并能够利用凝胶过滤层析法进行肝素的鉴定。
二、实验原理1. 肝素的提取：肝素是一种聚糖类物质，可从动物组织中提取。
常用的提取方法有碱水解法、酸水解法和酶解法。
本实验采用酶解法进行肝素的提取。
将动物组织经过清洗、切碎后加入适量的蛋白酶进行酶解，然后经过离心分离得到上清液，再经过乙醇沉淀得到粗品。
2. 肝素的纯化：通过凝胶层析法对粗品进行纯化。
将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中，利用凝胶柱中不同孔径大小的孔隙分离出不同分子量大小的肝素，并收集相应分子量大小范围内的肝素。
3. 肝素含量测定：利用显色反应测定肝素含量。
将样品与显色剂混合，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。
三、实验步骤1. 肝素的提取（1）清洗组织：将动物组织用生理盐水清洗干净。
（2）切碎组织：将清洗干净的组织切成小块。
（3）加入蛋白酶：将切碎后的组织加入适量的蛋白酶中进行酶解。
（4）离心分离：将酶解后的混合液进行离心分离，得到上清液。
（5）乙醇沉淀：将上清液加入等体积的乙醇中进行沉淀，得到粗品。
2. 肝素的纯化（1）制备缓冲液：配制0.1mol/L pH7.4磷缓冲液。
（2）柱层析：将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中进行层析。
收集不同分子量大小范围内的肝素。
3. 肝素含量测定（1）制备标准曲线：取一系列不同浓度的肝素标准品，加入显色剂后测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）测定样品：将纯化后的肝素样品加入显色剂中，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。
四、实验结果经过酶解和乙醇沉淀得到的粗品经过凝胶层析法进行纯化，得到了不同分子量大小范围内的肝素。
利用显色反应测定肝素含量，计算出不同分子量范围内的肝素含量。
五、实验结论本实验通过酶解法提取动物组织中的肝素，并通过凝胶层析法进行纯化。
最后利用显色反应测定肝素含量。
动物肝脏中DNA的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
动物肝脏中dna的提取和鉴定
动物肝脏中DNA的提取和鉴定一、实验目的1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。
由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA。
动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。
微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。
从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。
对于低等生物，如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。
从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。
细菌DNA相对分子质量较大，一般达2×109Da。
因此易被机械张力剪短。
细菌DNA，除核DNA外，还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。
天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA)。
DNA存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。
RNA存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。
要从细胞核中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离DNA。
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。
DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。
2018年如何从动物肝脏中提取一种酶-精品文档
实验原理
三， 盐析原理(Salting out )
蛋白质在水中以胶体形式存在是由于表面附有水化膜和表面 电荷，在盐析过程中，盐溶液中的离子破坏了这两个因素使 得蛋白质能够凝聚在一起沉淀下来达到分离的目的。利用离 心的方法将沉淀和上清液分离。
实验原理
四，等电点沉淀(Isoelectric point precipitation )
4，纯化 按照先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理 的方法，后选择精确、费时和需样品量少的方法的原则确定分离 方法的排布顺序。 5，鉴定 用于鉴定性质和含量的方法有：光谱法、气象层析法和生物 芯片法等。用于鉴定生物样品纯度的方法有：电泳法、免疫分析 。 根据实验目的确定鉴定方法，操作务必准确，尽量避免目标 物质的流失
1，正确选材 总的来说，材料选择应遵循的原则是：有效成分含量多，稳 定性好；来源丰富、保持新鲜；提取容易、工艺简单；杂质有综 合利用价值。 2，材料预处理 及时使用避免有效成分丧失，否则应及时冰冻或干燥储存， 同时把易于除去的非需要物质（如脂质）除去。 3，初分 根据目标大分子的性质确定初分方法，保证回收率高。
利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的 等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值或盐浓度，使酶或 杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。
实验原理
五，离子交换柱层析(Ion exchange column chromatography )，
按照可交换离子的类型分为阳离子交换柱色谱法和阴离子交换柱 色谱法。根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和解 吸而将电解质各组分分开。 在离子交换过程中，可以将杂蛋白选择性地结合到离子交换剂上 ，其余蛋白存在于过柱液中;或将欲分离蛋白选择性地结合到离子 交换剂上，杂蛋白存在于过柱液中;或几种带同性电荷的蛋白均结 合到交换剂上，利用其结合的牢固程度不同(即带电荷的数目不同 )，静电引力不同，分步洗脱下来，达到分离的目的。
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目的酶：由三种不同的亚基组成， 为结合酶，pl=6.2
一.材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。
1.细胞破碎
二.材料的处理
机械破碎法 粗处理时可将肝脏用剪刀剪成小块 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细 胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波 破碎法均可。 使用冻融法应注意不能在过高的温度 下操作，以免引起酶的变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机 试剂② 表面活性剂③ 螯合剂等。他们 都可以增加细胞膜的通透性，使酶容易 释放。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
2.防止蛋白酶的水解作用：
预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝 氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸：
一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸 污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂 的选择需要大量的试验来选定，已知的有 1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
三.酶的提取
1.常用方法：盐析法
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大 于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时， 中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面 的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分 子之间聚集而沉淀。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫 酸镁、硫酸铵等。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
影响酶提取的主要因素： 1. 酶在所使用溶剂中的溶解度； 2. 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度 （↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离 （↘）及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 3. 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有 利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引 起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
3.干燥：
将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分， 以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸 附干燥等。
真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密闭
干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条 件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结 收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空干 燥的温度一般控制在60℃以下。
Hale Waihona Puke .浓缩：从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度 酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤与 膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸 去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在60℃ 以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来，在 不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
4.pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以
免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
5.提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高
酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度
降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提
取液的总量一般为原料体积的3～5倍。 盐析法之后要进行透析