氨基酸分析
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＋AAs +ACN150℃2小时无水条件
2.分析方法：
毛细管 GC 可用一个色谱柱
其他常规GC,需用两个色谱柱，可分离常见AAs
检测器：电子捕获检测器
火焰离子化检测器，使用较多（通用型检测器）
四、高效液相色谱法
分离分析法
色谱分离 检测
柱前衍生化 柱后衍生化
1.检测问题
HPLC检测器：紫外、荧光、电化学Fra Baidu bibliotek
-CH2CH2CONH2谷氨酰胺Glutamine(Glu)
R-带负电荷基团
-CH2COOH天冬氨酸Aspartic acid（Asp）
-CH2CH2COOH谷氨酸Glutamic acid（Glu）
R-带正电荷基团
-CH2CH2CH2CH2NH2赖氨酸Lysine (Lys)
-CH2CH2CH2C(NH)NH2精氨酸Arginine (Arg)
——原因：氨基酸种类多
结构较相似
不经分离，难以直接分析，
现有直接分析方法，如酶、免疫分析法测定氨基酸选择性不够
——分离方法——高分辨分离技术：色谱、电泳
按分离方法，分为四部分：
——纸、薄层色谱
——电泳
——气相色谱
——高效液相色谱
一、纸色谱，薄层色谱法
色谱——固定相：纸色谱
薄层色谱——平面（板）液相色谱
—CH(CH2CH3)CH3丁基异亮氨酸Isoleucine(Ile)
CH2
NH CH2
HCCH2脯氨酸Proline (Pro)
COOH
—CH2—苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)
—CH2CH2SCH3蛋氨酸Methionine (Met)
—CH2—色氨酸Tryptophan(Typ,Trp)
⑶按衍生操作
在线衍生on－line可用于柱前或柱后衍生
脱线衍生off－line多用于柱前衍生
介绍具体衍生化方法及特点
② 茚三酮(ninhydrin)最成熟的方法
(1)过程
茚三酮 汇合 加热100℃570nm测A
(2)特点
成熟常用
可见检测，紫外也可
只能柱后衍生
灵敏度10-9mol 10uL10-4mol/L
第三章氨基酸分析（amino acids）AAs
第一节基础知识
一.概述
1.定义:
分子中至少含一个羧基(COOH),一个氨基（-NH2）的小分子量（100－200）有机物。
是存在于动植物体内的必要物质。
2.基本结构
CCCCCCOOH
NH2NH2NH2NH2
目前生物体内发现氨基酸180多种
参与蛋白组成（由蛋白质水解而得）的氨基酸20多种
---CH2---C====CH组氨酸Histidine (His)
NHN
CH2
不常见氨基酸
CH2—OH
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
NH2
HCCH2CH2CH(OH)CH2NH2
COOH
5-羟赖氨酸Hydroxylysine (Hyl)
三、立体异构体
只能柱前脱线衍生
灵敏度较高，比OPA高，激光荧光,amol10-18mol
毛细管电泳中常用
2.色谱分离
按柱前衍生柱后衍生
分离AAs衍生物分离AAs
分离对象不同
1分离AAs
色谱柱－离子交换色谱柱－填充阳离子交换树脂
强酸型－SO3H
洗脱剂－缓冲液+盐(柠檬酸钠)
原理－
□－SO3H→ 碱处理→ □-SO3Na+AAH+pH=2-3
常用⑴丁醇－醋酸－水（12：3：5）
⑵酚－水（160g：40ml）
分离方式：
——一维色谱分离
——二维色谱分离，为获得高分辨率
3点样 展开
溶剂前沿
氨基酸
XY
点样原点
RF=X/Y比移值——保留值——保留时间
一维色谱分离
二维色谱分离
借用图
横坐标：酚－水
纵坐标：丁醇－HAc－水
分离效率高
4定位：
最常用：
茚三酮ninhydrin兰紫色产物
R——不带电荷的极性基团
-H甘氨酸Glycine(Gly)
-CH2OH丝氨酸Serine(Ser)
-CH(OH)CH3苏氨酸Threonine(Thr)
-CH2SH半胱氨酸Cysteine(Cys)
-CH2--OH酪氨酸Tyrosine(Tyr)
-CH2CONH2天冬酰胺Asparagine(Asn)
一种重要荧光衍生化反应
OPA+AAs→→→ 产物
λex=340nm
λem=455nm
4. 与醛反应，形成西佛碱:
R-CHO+NH2-RCH-COOH→R-CH=N-RCH-COOH+H2O
固定化酶，或标记Ag Ab时所用的方法
5.脱氨基反应——酶催化反应
AAs氧化酶
AAs + O2→→→→→→→Oxoacid酮酸+ H2O2+ NH3
③OPA
(1)过程
OPA+AAs→pH9-10快速反应1－2min荧光产物 340
455nm
(2)特点
可柱前衍生 可柱后衍生
产物不稳定，1－2min后降解，只能在线衍生
需自动反应装置，否则重现性不好
灵敏度高pmol(10-12)-fmol(10-15)
只有伯氨氨基酸可衍生，（羟）脯氨酸不可
CH2—OH
——220－300nm， 酪、苯丙、色氨酸有吸收
（－）α氨基酸参加的反应
1.与亚硝酸
NH2OH
11
R-CH-COOH+HNO2→R-CH-COOH+N2↑+H2O
气量法测AAs的基础
2.与酰化试剂反应：弱碱条件下 氨基被酰（胺）化
著名 丹（磺）酰氯（Dansyl Chloride）AAs荧光衍生试剂
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
④丹酰氯
(1)一般柱前衍生。但试剂产物对色谱柱寿命有影响
条件：60℃10min
(2)可紫外 可荧光，pmol(10-12)水平灵敏度
⑤FITC异硫氰酸荧光素
⑴过程：
FITC+丙酮+AAs+pH9.2混合，避光放置过夜
⑵特点
——流动相
1.固定相
纸色谱－滤纸
薄层色谱－硅胶、氧化铝、纤维素粉——铺板，制板
2.流动相
多元流动相：水、丁醇、HAc，丙酮、酚，NH3……
根据不同要求：流动相具有不同组成，不同配比
3.分析方法
①试样预处理
采用阳离子交换柱、萃取、渗析——沉淀蛋白
去除干扰物：蛋白、盐、碳氢化合物
2选择溶剂系统
多种组合配比
→ □-SO3AAH++Na+
逐渐提高pH和Na.不同AAH+洗脱下来,梯度洗脱
由此原理生产氨基酸分析仪
检测
采用在线柱后衍生化方法,主要有两种:
⑴茚三酮p374结果见p378
⑵OPA
②分离AAs衍生物,如OPA,
提前衍生,反应1分钟.
色谱柱:碳18反相色谱柱;
洗脱剂Buffer+甲醇,四氢呋喃,梯度洗脱.
3.分析方法：
——一维电泳
——二维电泳－色谱分离
三、气相色谱法 （Gas Liquid Chromatography）
1.试样的衍生化
——问题提出：GC要求 样品可气化，AAs难气化
——衍生化方法：
·试剂：常用三甲基硅烷(Trimethylsilyl TMS对AAs衍生
·方法：
N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)
1.α-氨基酸
NH2
HCR
COOH
αC除甘氨酸外，其中αC上四个取代基不同，为手性C，手性异构体（isomers）Stereo立体，
enantiomers对映体
2.氨基酸立体异构体分类
——按绝对构型（absolute configuration）
左旋L型，右旋D型，
与标准物——甘油醛比较而定
L-甘油醛glyceraldehydeD-甘油醛
紫外：AAs末端吸收，<220nm，可用，但灵敏度低
荧光：AAs无荧光
电化学：干扰、稳定性
需进行衍生化
① 衍生化分类(derivation)
⑴按不同的衍生化试剂
常用：
——茚三酮
——邻苯二甲醛（OPA）
——丹酰氯 FMDC
⑵按分离前后顺序
——柱前衍生pre-column
——柱后衍生post-column
检测:340nm 455nm
4.定量分析:
AAs标准品,工作曲线,
试样 定量
五.用途
1.氨基酸分析,药品,食品,饲料，临床
2. 蛋白质分析
L-丙氨酸D-丙氨酸
3.分布
——蛋白质经温和水解后，其中α-氨基酸都是L型氨基酸
——虽然自然界中，存在有D型氨基酸
——人工合成氨基酸 DL消旋体racemate（DL等mol混合物）
四、氨基酸的酸碱性质
1.基本性质:
——酸-COOH失H＋
——碱-NH2得H+， 形成两性离子，两性电解质
两性解离
2.氨基酸得解离过程
以丙氨酸为例，以NaOH的滴定：
PI——iso-ionic pH (PI)
等离子点pH
在某pH,每个氨基酸分子带正负电荷相等，分子表观净电荷为0。
PI——iso-electric point
等电点
在某pH，每个分子呈电中性，在电场中无电泳迁移
五、反应
UV Vis——20种α氨基酸
——可见区 无吸收
——<220nm，有紫外吸收
α-羧基参与的反应,分析化学中应用不多
（二）α-氨基与α-羧基共同参与的反应
1.与茚三酮反应(Ninhydrin)
分析化学最常用氨基酸衍生方法
水合茚三酮+ AAs→→ 还原茚三酮+AAs被分解→→
兰紫色产物 570nm测A.
有紫外吸收
2.成肽反应Peptide
以后详细讲
第二节 氨基酸分析
氨基酸分析――分离分析方法
茚三酮邻苯二甲醛opafmdc按分离前后顺序柱前衍生precolumn柱后衍生postcolumn20按衍生操作在线衍生online可用于柱前或柱后衍生脱线衍生offline多用于柱前衍生介绍具体衍生化方法及特点茚三酮ninhydrin最成熟的方法1过程茚三酮汇合加热100570nm测a2特点灵敏度109mol10ul104mollopa1过程opaaasph910快速反应12min荧光产物340455nm2特点可柱前衍生可柱后衍生产物不稳定12min后降解只能在线衍生21灵敏度高pmol1012fmol1015只有伯氨氨基酸可衍生羟脯氨酸不可ch2ohnhch2hcch24羟脯氨酸hydroxyprolinehyp1一般柱前衍生
产物——有UV吸收
——有荧光λex=340nm
λem=455nm
3.烃基化反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
Sanger反应,用于鉴定氨基酸方程式
荧光胺（Fluorescamine）+AAs→→→产物λex=390nm
λem=475nm
邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)反应
都是α-氨基酸，除了:
脯氨酸羟脯氨酸
其中20种常见氨基酸，几种不常见氨基酸
二、分类
α-氨基酸通式：–COOH、-NH2在同一个C上。不同氨基酸在于R不同
NH2
HCR
COOH
R——非极性基团
—CH3甲基丙氨酸Alanine (Ala)
—CH2(CH3)2异丙基缬氨酸Valine(Val)
—CH2CH(CH3)2异丁基亮氨酸Leucine (Leu)
其它：
Sanger反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
丹酰氯AAs——有荧光λex=340nm
λem=455nm常用于分离前衍生化
⑤应用
定性：利用RF，在三个不同的溶剂系统下，确证
半定量：重现性不好
定量：扫描 挖点
二、电泳法
1.支持物：纸、纤维素膜、硅胶
2.缓冲液体系：常见pH2.0 pH5.3
2.分析方法：
毛细管 GC 可用一个色谱柱
其他常规GC,需用两个色谱柱，可分离常见AAs
检测器：电子捕获检测器
火焰离子化检测器，使用较多（通用型检测器）
四、高效液相色谱法
分离分析法
色谱分离 检测
柱前衍生化 柱后衍生化
1.检测问题
HPLC检测器：紫外、荧光、电化学Fra Baidu bibliotek
-CH2CH2CONH2谷氨酰胺Glutamine(Glu)
R-带负电荷基团
-CH2COOH天冬氨酸Aspartic acid（Asp）
-CH2CH2COOH谷氨酸Glutamic acid（Glu）
R-带正电荷基团
-CH2CH2CH2CH2NH2赖氨酸Lysine (Lys)
-CH2CH2CH2C(NH)NH2精氨酸Arginine (Arg)
——原因：氨基酸种类多
结构较相似
不经分离，难以直接分析，
现有直接分析方法，如酶、免疫分析法测定氨基酸选择性不够
——分离方法——高分辨分离技术：色谱、电泳
按分离方法，分为四部分：
——纸、薄层色谱
——电泳
——气相色谱
——高效液相色谱
一、纸色谱，薄层色谱法
色谱——固定相：纸色谱
薄层色谱——平面（板）液相色谱
—CH(CH2CH3)CH3丁基异亮氨酸Isoleucine(Ile)
CH2
NH CH2
HCCH2脯氨酸Proline (Pro)
COOH
—CH2—苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)
—CH2CH2SCH3蛋氨酸Methionine (Met)
—CH2—色氨酸Tryptophan(Typ,Trp)
⑶按衍生操作
在线衍生on－line可用于柱前或柱后衍生
脱线衍生off－line多用于柱前衍生
介绍具体衍生化方法及特点
② 茚三酮(ninhydrin)最成熟的方法
(1)过程
茚三酮 汇合 加热100℃570nm测A
(2)特点
成熟常用
可见检测，紫外也可
只能柱后衍生
灵敏度10-9mol 10uL10-4mol/L
第三章氨基酸分析（amino acids）AAs
第一节基础知识
一.概述
1.定义:
分子中至少含一个羧基(COOH),一个氨基（-NH2）的小分子量（100－200）有机物。
是存在于动植物体内的必要物质。
2.基本结构
CCCCCCOOH
NH2NH2NH2NH2
目前生物体内发现氨基酸180多种
参与蛋白组成（由蛋白质水解而得）的氨基酸20多种
---CH2---C====CH组氨酸Histidine (His)
NHN
CH2
不常见氨基酸
CH2—OH
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
NH2
HCCH2CH2CH(OH)CH2NH2
COOH
5-羟赖氨酸Hydroxylysine (Hyl)
三、立体异构体
只能柱前脱线衍生
灵敏度较高，比OPA高，激光荧光,amol10-18mol
毛细管电泳中常用
2.色谱分离
按柱前衍生柱后衍生
分离AAs衍生物分离AAs
分离对象不同
1分离AAs
色谱柱－离子交换色谱柱－填充阳离子交换树脂
强酸型－SO3H
洗脱剂－缓冲液+盐(柠檬酸钠)
原理－
□－SO3H→ 碱处理→ □-SO3Na+AAH+pH=2-3
常用⑴丁醇－醋酸－水（12：3：5）
⑵酚－水（160g：40ml）
分离方式：
——一维色谱分离
——二维色谱分离，为获得高分辨率
3点样 展开
溶剂前沿
氨基酸
XY
点样原点
RF=X/Y比移值——保留值——保留时间
一维色谱分离
二维色谱分离
借用图
横坐标：酚－水
纵坐标：丁醇－HAc－水
分离效率高
4定位：
最常用：
茚三酮ninhydrin兰紫色产物
R——不带电荷的极性基团
-H甘氨酸Glycine(Gly)
-CH2OH丝氨酸Serine(Ser)
-CH(OH)CH3苏氨酸Threonine(Thr)
-CH2SH半胱氨酸Cysteine(Cys)
-CH2--OH酪氨酸Tyrosine(Tyr)
-CH2CONH2天冬酰胺Asparagine(Asn)
一种重要荧光衍生化反应
OPA+AAs→→→ 产物
λex=340nm
λem=455nm
4. 与醛反应，形成西佛碱:
R-CHO+NH2-RCH-COOH→R-CH=N-RCH-COOH+H2O
固定化酶，或标记Ag Ab时所用的方法
5.脱氨基反应——酶催化反应
AAs氧化酶
AAs + O2→→→→→→→Oxoacid酮酸+ H2O2+ NH3
③OPA
(1)过程
OPA+AAs→pH9-10快速反应1－2min荧光产物 340
455nm
(2)特点
可柱前衍生 可柱后衍生
产物不稳定，1－2min后降解，只能在线衍生
需自动反应装置，否则重现性不好
灵敏度高pmol(10-12)-fmol(10-15)
只有伯氨氨基酸可衍生，（羟）脯氨酸不可
CH2—OH
——220－300nm， 酪、苯丙、色氨酸有吸收
（－）α氨基酸参加的反应
1.与亚硝酸
NH2OH
11
R-CH-COOH+HNO2→R-CH-COOH+N2↑+H2O
气量法测AAs的基础
2.与酰化试剂反应：弱碱条件下 氨基被酰（胺）化
著名 丹（磺）酰氯（Dansyl Chloride）AAs荧光衍生试剂
NH CH2
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
COOH
④丹酰氯
(1)一般柱前衍生。但试剂产物对色谱柱寿命有影响
条件：60℃10min
(2)可紫外 可荧光，pmol(10-12)水平灵敏度
⑤FITC异硫氰酸荧光素
⑴过程：
FITC+丙酮+AAs+pH9.2混合，避光放置过夜
⑵特点
——流动相
1.固定相
纸色谱－滤纸
薄层色谱－硅胶、氧化铝、纤维素粉——铺板，制板
2.流动相
多元流动相：水、丁醇、HAc，丙酮、酚，NH3……
根据不同要求：流动相具有不同组成，不同配比
3.分析方法
①试样预处理
采用阳离子交换柱、萃取、渗析——沉淀蛋白
去除干扰物：蛋白、盐、碳氢化合物
2选择溶剂系统
多种组合配比
→ □-SO3AAH++Na+
逐渐提高pH和Na.不同AAH+洗脱下来,梯度洗脱
由此原理生产氨基酸分析仪
检测
采用在线柱后衍生化方法,主要有两种:
⑴茚三酮p374结果见p378
⑵OPA
②分离AAs衍生物,如OPA,
提前衍生,反应1分钟.
色谱柱:碳18反相色谱柱;
洗脱剂Buffer+甲醇,四氢呋喃,梯度洗脱.
3.分析方法：
——一维电泳
——二维电泳－色谱分离
三、气相色谱法 （Gas Liquid Chromatography）
1.试样的衍生化
——问题提出：GC要求 样品可气化，AAs难气化
——衍生化方法：
·试剂：常用三甲基硅烷(Trimethylsilyl TMS对AAs衍生
·方法：
N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)
1.α-氨基酸
NH2
HCR
COOH
αC除甘氨酸外，其中αC上四个取代基不同，为手性C，手性异构体（isomers）Stereo立体，
enantiomers对映体
2.氨基酸立体异构体分类
——按绝对构型（absolute configuration）
左旋L型，右旋D型，
与标准物——甘油醛比较而定
L-甘油醛glyceraldehydeD-甘油醛
紫外：AAs末端吸收，<220nm，可用，但灵敏度低
荧光：AAs无荧光
电化学：干扰、稳定性
需进行衍生化
① 衍生化分类(derivation)
⑴按不同的衍生化试剂
常用：
——茚三酮
——邻苯二甲醛（OPA）
——丹酰氯 FMDC
⑵按分离前后顺序
——柱前衍生pre-column
——柱后衍生post-column
检测:340nm 455nm
4.定量分析:
AAs标准品,工作曲线,
试样 定量
五.用途
1.氨基酸分析,药品,食品,饲料，临床
2. 蛋白质分析
L-丙氨酸D-丙氨酸
3.分布
——蛋白质经温和水解后，其中α-氨基酸都是L型氨基酸
——虽然自然界中，存在有D型氨基酸
——人工合成氨基酸 DL消旋体racemate（DL等mol混合物）
四、氨基酸的酸碱性质
1.基本性质:
——酸-COOH失H＋
——碱-NH2得H+， 形成两性离子，两性电解质
两性解离
2.氨基酸得解离过程
以丙氨酸为例，以NaOH的滴定：
PI——iso-ionic pH (PI)
等离子点pH
在某pH,每个氨基酸分子带正负电荷相等，分子表观净电荷为0。
PI——iso-electric point
等电点
在某pH，每个分子呈电中性，在电场中无电泳迁移
五、反应
UV Vis——20种α氨基酸
——可见区 无吸收
——<220nm，有紫外吸收
α-羧基参与的反应,分析化学中应用不多
（二）α-氨基与α-羧基共同参与的反应
1.与茚三酮反应(Ninhydrin)
分析化学最常用氨基酸衍生方法
水合茚三酮+ AAs→→ 还原茚三酮+AAs被分解→→
兰紫色产物 570nm测A.
有紫外吸收
2.成肽反应Peptide
以后详细讲
第二节 氨基酸分析
氨基酸分析――分离分析方法
茚三酮邻苯二甲醛opafmdc按分离前后顺序柱前衍生precolumn柱后衍生postcolumn20按衍生操作在线衍生online可用于柱前或柱后衍生脱线衍生offline多用于柱前衍生介绍具体衍生化方法及特点茚三酮ninhydrin最成熟的方法1过程茚三酮汇合加热100570nm测a2特点灵敏度109mol10ul104mollopa1过程opaaasph910快速反应12min荧光产物340455nm2特点可柱前衍生可柱后衍生产物不稳定12min后降解只能在线衍生21灵敏度高pmol1012fmol1015只有伯氨氨基酸可衍生羟脯氨酸不可ch2ohnhch2hcch24羟脯氨酸hydroxyprolinehyp1一般柱前衍生
产物——有UV吸收
——有荧光λex=340nm
λem=455nm
3.烃基化反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
Sanger反应,用于鉴定氨基酸方程式
荧光胺（Fluorescamine）+AAs→→→产物λex=390nm
λem=475nm
邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)反应
都是α-氨基酸，除了:
脯氨酸羟脯氨酸
其中20种常见氨基酸，几种不常见氨基酸
二、分类
α-氨基酸通式：–COOH、-NH2在同一个C上。不同氨基酸在于R不同
NH2
HCR
COOH
R——非极性基团
—CH3甲基丙氨酸Alanine (Ala)
—CH2(CH3)2异丙基缬氨酸Valine(Val)
—CH2CH(CH3)2异丁基亮氨酸Leucine (Leu)
其它：
Sanger反应
2，4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
丹酰氯AAs——有荧光λex=340nm
λem=455nm常用于分离前衍生化
⑤应用
定性：利用RF，在三个不同的溶剂系统下，确证
半定量：重现性不好
定量：扫描 挖点
二、电泳法
1.支持物：纸、纤维素膜、硅胶
2.缓冲液体系：常见pH2.0 pH5.3