外周血细胞形态分析标准操作程序

外周血细胞形态分析标准操作程序1 检验目的规范外周血细胞形态学检查，对各仪器达到复检规则的样本进行复片检查，给临床有关疾病的诊断、观察疾病的变化及治疗效果提供重要的参考依据。

2 用于检验程序的原理把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，用瑞氏-姬姆萨染料染色，观察各种细胞数量、形态和质量的变化。

3 性能参数不适用。

4 原始样品系统血液标本详见《血常规标本的采集与处理程序》。

5 容器和添加剂类型血液标本采集的容器是一次性含 EDTA-K2 抗凝剂的真空采血管；添加剂是EDTA-K2 抗凝剂。

采集方法：准确采集静脉血 2.0ml 于上述容器中，轻轻颠倒混匀或直接取手指血 20μl。

要求量准，采血顺利，不能出现凝块。

取手指血或抗凝血于洁净的玻片上制片。

6 所需设备和试剂6.1 仪器、器材：显微镜或 DM96 自动阅片机、玻片6.2 试剂6.2.1 瑞氏-姬姆萨染色液6.2.2 磷酸盐缓冲液（自配）：称取 10 克 KH2PO4，用 1000ml 蒸馏水溶解为 1%浓度的 KH2PO4 溶液，称取 7 克 NaHPO4，用 700ml 蒸馏水溶解为 1%浓度的2Na2HPO4 溶液，取 900 毫升 1%浓度的 KH2PO4溶液和 600 毫升 1%浓度的Na2HPO4 溶液混匀，再用蒸馏水加至 3000 毫升，充分混匀。

配制的缓冲液的 pH 值范围应该在 6.4-6.8。

7 程序步骤仪器器材/试剂准备→样本编号→制片→染色→镜检→分析测定结果→结果审核签发。

应在取血后4小时内完成血涂片制作。

7.1 样本编号按顺序将样本编号，认真核对检验目的、病人姓名、性别、科室、床号、血液质量，如有疑问应及时与临床联系。

如采血量不够、有凝块或有溶血现象等，须申请重留标本。

7.2 制片采用 SP1000I 自动推片机或手工制片。

将样本混匀后取 5～10ul 滴于玻片上，并在玻片上注明患者姓名、样本编号，推制厚薄适宜的血膜片。

良好血涂片的要求：①血膜长度 25～35mm，宽度 18～20mm，血膜四周留有空隙区，且边缘光滑，血膜终尾离玻片终端至少 10mm，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，血膜应呈舌状，具有头、体、尾不同厚薄区域，从厚区到薄区逐步均匀分布。

②血膜末端无粒状、划线或裂隙，所有这些情况会使白细胞集中在这些区域内。

③在镜检区域内，白细胞形态应无人为异常改变。

通常，随着保存时间的延长，抗凝血会造成白细胞形态的改变，如胞浆内形成空泡，核分解破裂等。

应将抗凝血液保存时间的影响减小到最低限度。

除部分淋巴细胞增生性疾病外，镜检区域内破损白细胞量应<2％。

④无人为污染。

⑤在 1 小时内用瑞氏-姬姆萨复合染色液染色；或在 1 小时内，用无水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。

7.3 染色采用 SP1000I 自动推片机或手工染色。

推好的血膜在空气中晃动，以促使快干。

天气寒冷或潮湿时，应于 37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。

待血膜片干燥后，平置于染色架上，滴加染液 3～5 滴，使其迅速盖满血膜，约 1 分钟后，滴加缓冲液 5～10 滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混合，5～10 分钟后用水冲去染液（在室温较低时，应适当延长染色时间），待干。

7.4 血涂片的观察方法采用 DM96 自动阅片机或显微镜镜检：首先进行白细胞分类，并记录白细胞形态；连续观察 20 个视野红细胞的排列、分布及形态；观察血小板分布及形态；发现血液寄生虫时，应仔细观察，并进行鉴定。

具体方法如下：7.4.1 肉眼观察在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。

如果是正常的血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨髓瘤的高γ球蛋白血症等情况下，血涂片会略带蓝色，此时应意识到可能为异常标本。

7.4.2 低倍镜/高倍镜下观察在低倍镜下浏览全片，观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。

选择涂片体尾部红细胞分布均匀的体尾交界处进行油镜观察。

7.4.3 油镜下观察边移动视野边观察下列各项：（1）染色是否良好：如果血涂片染色确实不好，应重新染色。

（2）观察白细胞形态并进行分类计数，在油镜下计数 100 个白细胞，按其形态特征进行分类计数，求出各类细胞所占比值（百分率）。

（3）观察红细胞形态：①观察有无人为造成的变形，此外有时载玻片上的碱性物质的溶出（玻璃效应）会导致红细胞呈严重的棘形红细胞。

如固定不良（固定液中含有水分时）会导致呈面包圈形红细胞，从而无法观察红细胞的形态。

②观察红细胞大小及有无红细胞大小不一。

凡直径＞10um 者称大红细胞，＞15um 者称巨红细胞，＜6um 者称为小红细胞。

③观察红细胞形态，注意有无畸形红细胞，如球形红细胞、椭圆形红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞）、中心淡染红细胞、棘形红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破碎红细胞及镰状红细胞等。

④观察是否有染色性的变化，如有无嗜多色性红细胞、中心淡染红细胞等。

红细胞中心区淡染的判断标准是根据视野中查见半数以上红细胞中心淡染区直径与红细胞直径之比进行记录，中心淡染区<1/3 为（—），中心淡染区>1/3 而<1/2 为（+）。

中心淡染区>1/2 为（++），呈环形为（+++）。

⑤观察红细胞内有无异常。

如是否有嗜碱性点彩、豪-周小体、卡波环状体红细胞、幼红细胞、疟原虫等。

⑥红细胞形态不均和形态异常的判断标准：每视野 0～1 个为阴性，2～10 个为(+)，11～30 个为(++)，31 个以上为(+++)。

（4）观察血小板形态①通过与红细胞的比较，判断血小板数量是否正常。

正常情况下每 15～20 个红细胞中有 1 个血小板。

②注意大小的变化。

③观察未加抗凝剂而直接从毛细血管采集的标本时，要注意血小板的凝集性，正常情况下可见若干血小板凝集。

7.4.4 采用 DM96 自动阅片机阅片，具体操作见《DM96 自动阅片机作业指导书》。

7.5 外周血细胞形态学报告内容①白细胞分类比例；②有无不成熟白细胞、有核红细胞及其他异常细胞、寄生虫等；③成熟红细胞形态；④血小板数量、形态、聚集性。

7.6 检验结果的输入：同《全血细胞计数检查标准操作程序》。

7.7 检验结果的确认：分析评审检验结果，评价其与可利用的患者有关临床信息的符合性，审核确认报告。

7.8 检测完标本的处理：同《全血细胞计数检查标准操作程序》。

8 质量控制程序8.1 白细胞总数在（3.0~15.0）×109/L 之间者，分类计数 100 个白细胞。

总数在 15.0×109/L 以上时，应分类计数 200 个白细胞；总数低于 3.0×109/L 时，则应选用 2 张血涂片分类计数 50~100 个白细胞。

8.2 手工制备的血涂片细胞分布不均匀，很难对每张血涂片进行严格的质量控制，关键在于熟练操作技术，严格控制各个操作环节，尽量减少误差，同时由于细胞形态变化较大，应经常由高年资细胞学专业人员进行核实，以减少误差。

9 干扰和交叉反应9.1 细胞分布不均：一般涂片尾部中性粒细胞较多，淋巴细胞较少，宜选择体尾交界处计数。

9.2 细胞形态识别存在差异，如对杆状核和分叶核细胞诊断标准的不同。

9.3 白细胞分类计数时要有秩序的、沿一定方向连续的进行，从血膜体尾交界处血膜边缘向中央依次上下或左右呈曲线移动，避免漏数和重复计数，避免主观选择视野。

9.4 涂片染色质量不佳。

9.5 分类计数白细胞的数量达不到要求亦会增加检验误差。

9.6 为尽量减少误差，白细胞分类计数应注意以下几点：①制作血涂片时要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为 25 mm×75mm，厚度为 0.8～1.2mm。

并有明确标记。

如果样本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片。

推片质优，两端边缘整齐、平滑，涂片时，还应考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、WBC 或有核细胞多少等因素，调整推片角度。

②细胞染色对氢离子浓度十分敏感，稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则各种细胞染色反应异常，致使细胞的识别困难，甚至造成错误。

③染色时间与染液浓度、室温高低、细胞多少有关，染液越淡，室温越低，细胞越多，所需染色时间越长或应适当增加染液量，因此染色时间应视具体情况而定，特别是更换新染料时必须经试染，摸索最佳染色条件，染色时应注意保护血膜尾部细胞，不能划掉，因为体积较大细胞常在此处出现。

④染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。

⑤染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。

⑥细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。

⑦新鲜涂片最好立即染色。

⑧分类计数同时应注意观察红细胞形态、肿瘤细胞和未成熟细胞，留心发现血液寄生虫和特殊细胞。

⑨中性粒细胞异常表现核象变化即核左移和核右移；毒性变化即退行性变（空泡、肿胀、肿胀、溶解等）和毒性颗粒，严重者可以见到 Dohle 体（胞浆中出现嗜碱性点、线、块状和云雾状物质）。

⑩要注意异形淋巴细胞其特征为Ⅰ型（空泡型）：细胞类圆形，胞浆染蓝色，呈泡沫状，核呈圆形或肾形等；Ⅱ型（不规则型）：胞体不规则，胞浆量丰富，染浅蓝色，边缘略深，核形不规则，有凹陷，核染色质不同于单核细胞较厚实；Ⅲ型（幼稚型）：酷似原始细胞，但胞浆量较多，核染色质较粗糙，可伴随其它两型细胞出现。

⑾有核红细胞不计入 100 个白细胞内，以分类计数 100 个白细胞见到多少个有核红细胞报告，并注明幼红细胞所属阶段。

⑿除特殊情况外（如慢性淋巴细胞白血病），涂片中的破碎细胞及不能识别细胞数不超过 2%，若破碎细胞仍能明确鉴别，应包含在分类结果中，在结果报告时，对不能识别的细胞或破碎细胞应作适当描述。

10 生物参考区间10.1 白细胞分类生物参考区间：细胞类别成人中性粒细胞 50%-70%嗜酸性粒细胞 0.5%-5%嗜碱性粒细胞 0%-1%淋巴细胞 20%-40%单核细胞 3%-10%10.2 五种白细胞正常形态如下：10.2.1 中性粒细胞细胞呈圆形，直径 10～13μm，胞核染色为深紫红色，核染色质紧密呈团块状。

核形弯曲呈杆状者称杆状核，有时核弯曲盘绕呈 C 形、S 形、V 形或不规则形；核呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。

细胞核一般为 2～5 叶，正常人以 2～3 叶者居多。

中性粒细胞的胞质丰富，染成粉红色，含有许多细小的淡紫色及淡红色颗粒。

10.2.2 嗜酸性粒细胞胞体呈圆形，直径 13～15μm，核常为 2 叶，呈眼镜样，胞质内充满粗大、整齐、均匀、紧密排列、折光性强的嗜酸性颗粒，染成桔红色或砖红色。

10.2.3 嗜碱性粒细胞胞体呈圆形，直径 10～12μm。

胞质内含有少量粗大但大小不等、排列不规则染成黑蓝色或蓝紫色嗜碱性颗粒，可覆盖在核上。