液体配制及实验方法

(一)液体配制

1.完全培养基

DMEM+10%FBS+1%双抗+(1%HAPS液)

若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺

2.PBS

1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4

3.胰酶

用之前调节PH值至7.6

4.CaCl2

将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液

每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液(终浓度3μmol/L)用于激活胶原酶

的活性

5.双抗

终浓度:青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml

青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位

称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml

6.两性霉素B

100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中,制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液

每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液,稀释为终浓度2.5μg/ml

7.细胞冻存液

20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)

8STZ溶液

STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中

称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ 溶液,调节PH值至4.5,4°避光保存,由于STZ水溶性不稳定,溶液最好在半小时内使用完毕.

9油红O

原液:油红O 0.6g溶于异丙醇(99% )100ml 。

稀释液:油红O 原液20ml ,蒸馏水20ml ,过滤后使用。

10茜素红

称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS,调节PH值到7.2,过滤后使用.

11成骨诱导液

配方:DMEM(H)+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松

+50mg/LVitC

1)β-甘油磷酸钠分子量:216 溶于水

10mmol/L=216mg/100ml

称取216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中

2)地塞米松分子量:392.5 在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.

0.1μmol/L=0.04mg/L

将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中制成25000X的浓缩液

每100ml低糖完全培养基中加入4μl地塞米松浓缩液

3)VitC分子量176.1 溶于水

称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中

12成脂诱导液

配方:DMEM(L)+10%FBS+10μmol/L地塞米松+200μmol/L吲哚美辛

+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)+10mg/L胰岛素

1)每100ml高糖完全培养基中400μl地塞米松浓缩液

2)吲哚美辛分子量:357.79 在无水乙醇中的溶解度为1g/50ml PH 7.4以下

0.2mmol/L=7.16mg/100ml

称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇制成200X的浓缩液

每100ml高糖完全培养基中加入500μl吲哚美辛浓缩液

3)IBMX分子量:222.25 在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml)

0.5mmol/L=1.1mg/100ml

将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)浓缩液

每100ml高糖完全培养基中加入11μlIBMX浓缩液

4)Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X)

每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100μl.

溶解粉末时均需先用少量液体溶解,再定容。

(二)细胞培养

1.骨髓基质干细胞(BMSC)、脂肪基质干细胞(ADSC)的原代培养

1)准备工作

所需液体:培养基,血清(FBS),胶原酶

消毒(器械、烧杯、滤纸、离心管等)(PBS,枪头,青瓶和塞子,5套器械+3~4个烧杯+滤纸,离心管50+15ml)

水浴锅调节温度至37°预热

配制BMSC清洗液将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素

配制ADSC清洗液由于脂肪组织易污染,故将清洗液装入青瓶中,每100mlPBS 加2%双抗和20~40ul两性霉素

配制骨髓冲洗液(PBS+3%FBS)即300ul血清

BMSC冲洗液及胶原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热

2)取组织

将SD大鼠(4周60-80g)引颈处死,用75%酒精浸泡5-10分钟

取大鼠内脏脂肪,取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染,将

取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中

取大鼠长骨,尽量将附着的肌肉剔除干净,若骨头断裂髓腔暴露,污染可能性大,弃之。

将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次

3)收集细胞

ADSC: 将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎,加入适量II型胶原酶(每

1ml脂肪组织加1ml胶原酶)以及CaCl2(200X),将混合物移至15ml离心管中37°C

水浴30分钟(每间隔十分钟震荡15秒),30分钟后将混悬液用细胞筛网滤过,

并用终止夜(10%FBS的PBS)2ml终止消化,收集液体至离心管,1500rpm离

心5-6分钟,弃上清重悬细胞,细胞计数并种入培养瓶中,加适量培养基,在培

养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.

BMSC:用器械剪去长骨两端,暴露骨髓腔,5ml注射器冲洗骨髓腔,收集液体至

离心管,1000rpm离心8分钟,弃上清重悬细胞,细胞计数并种入培养瓶中,加适

量培养基,在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.