高效液相色谱速率理论
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理
1．基本概念
色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)
保留值：保留时间、死时间、调整保留时间
峰宽：标准差、半峰宽、峰宽（色谱峰展宽是指由于柱内外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成柱效降低）
2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程
理论塔板数 n=5.54(tr/wh/2)2
色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高；同样长度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素
范氏方程 h=a b/μ cμ
a为涡流扩散项。
采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散
b为纵向扩散系数。
流动相为液体，柱温为室温，b/μ可忽略不计
c为传质阻抗系数。
在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
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（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
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液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
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液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
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小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
高效液相色谱分类及工作原理
阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
学习液相，必须要知道的三大理论
学习液相，必须要知道的三大理论写在前面高效液相色谱我们常用，如何操作自然难不倒我们，那么，液相色谱的分析的理论基础是什么？这个你知道吗？这一篇咱们好好学一学液相色谱的分析理论基础，可以让你更好地使用高效液相色谱仪。
在说分析的理论基础之前，问大家一个问题，为什么液相色谱柱的内径都不是整数呢？”例如:1.7、1.9、2.1、4.6这是为什么呢？想了解真相？往下看色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相的分配系数决定的，即色谱过程的热力学性质有关。
但是两峰间虽有一定的距离，如果每个峰都很宽，以至彼此重叠，还是不能分开。
这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程中的动力学性质有关。
因此要从动力学和热力学两方面来研究色谱行为。
色谱热力学理论主要研究溶质在色谱柱内的分离机制及分子特征与分离结果之间的关系；色谱动力学主要研究溶质在色谱柱中的运输规律，解释色谱流出曲线的形状、影响色谱区带展宽及峰形的因素，从而为获得高效能色谱分离结果提供理论指导，为峰形预测、重叠峰的定量解析以及选择最佳色谱分离方法奠定理论基础。
先复习一下仪器分析的重点——色谱分析的三大理论。
1相平衡理论相平衡理论认为溶质在流动相和固定相之间达到平衡。
分配（吸附）色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配（吸附-脱附）过程，在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比K分配系数，分配系数是由组分在两相的热力学性质决定的。
在一定温度下，分配系数K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱。
K=Cs/Cm lnK=-△Gm/RTc由上式可以看出分配系数和温度呈反比，升高温度，分配系数变小，组分在固定相的浓度减小，可缩短出峰时间。
分配比κ又称容量因子，它是在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比κ=ms/mm，κ越大说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量越大，因此又称分配容量比或容量因子。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
液相色谱工作总结
液相色谱工作总结篇一：高效液相总结高效液相色谱中的速率理论范氏方程：H＝A＋CuA = 2λdp 在 HPLC中为了降低涡流扩散的影响:采用了3－10um的小颗粒球形固定相采用高压匀浆Cd－为常数Cs－常数 Bu?CdDmuDs－为组分在固定相中的扩散系数df_ －为固定液涂层厚度 Hs?CSdfuDs2在HPLC中，流动相是液体其粘度比气体大得多，而且是在室温下进行操作。
因此组分在流动相中的扩散系数Dm 比GC中的Dg要小得多。
另外HPLC流动相的流速快，所以纵向扩散项对谱带扩张的影响很小，可以忽略不計。
故在H －u曲线中没极小值根据速率理论HPLC的实验条件为：1.小粒度、均匀的球形化学鍵合相；2.低粘度流动相，流速不宜快；3.柱温适当流动相在高效液相色谱中所用的流动相也称洗脱剂，溶解样品用的溶剂最好就是洗脱剂。
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。
因此流动相不仅起洗脱作用，还参与分离过程，在固定相一定时，HPLC中,n由色谱柱质量决定，α主要受溶剂种类的影响，κ受溶剂配比的影响。
若固定相一定，改变流动相的组成就可以r21使改变；改变流动相中各种溶剂的配比，就能有效地控制k值。
用分离方程讨论流动相对分离的影响注意HPLC与GC不同在HPLC中，当固定相一定时，流动相的种类影响选择因子，配比影响容因子。
因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。
在GC中，流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用，因此，α主要受固定相性质影响,κ主要受柱温影响，在GC中，以选择固定相和改变柱温来改善分离度。
（1）不允许使用能引起柱效能损失或柱保留特性变化的溶剂。
（2）溶剂对于试样，必须具有适当的溶解度和良好的选择性。
3）溶剂要与检测器匹配。
对于紫外吸收检测器，应注意选择检测波长比溶剂的紫外截止波长要长。
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
高效液相色谱法原理
高效液相色谱法原理
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种常用的分离和分析方法，其原理基于样品中的
化合物在液相流动载体中与固定在填料上的固定相相互作用，并因此在色谱柱上发生不同程度的分配和保留。
在高压下，样品通过色谱柱，各组分依据其与移动相和固定相的相互作用的不同，在柱中以不同速率进行分离。
高效液相色谱法的主要组成部分包括进样器、色谱柱和检测器。
样品首先通过进样器注入到移动相中，然后进入色谱柱。
色谱柱是由一种固定相填充而成的管状结构，固定相表面有一定数目的固定相基团，用于化合物的分离。
移动相则是一种液态溶剂，可以根据需要选用不同的组合，并通过高压泵以一定流速通过色谱柱。
化合物在色谱柱中与固定相发生相互作用，有选择性地被保留或分离。
不同的化合物在色谱柱中的相互作用程度不同，因此它们以不同的速率通过色谱柱。
通过控制柱温、移动相成分、流速和色谱柱填料等条件，可以调节分离效果。
最后，分离的化合物进入检测器进行检测和信号记录。
高效液相色谱法广泛应用于许多领域，包括药物分析、环境监测、食品安全等。
其优点在于对大多数化合物具有良好的分离选择性、灵敏度高、分析速度快、操作简便。
同时，该方法还可以与其他分离技术（如质谱联用）进行联用，以提高分析的灵敏度和准确性。
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
高效液相色谱法分离条件的选择
• 4 、固定相颗粒粒度对塔板高度的影响 • 由于A 、Cm和 Csm均随固定相颗粒粒度dp的变小而变小，
而且实验还表明固体相颗粒粒度越小，柱效受流动相线速 度的影响也越小。
• 所以根据速率理论，HPLC的实验条件应该是： ①小粒度、均匀的球形化学键合相； ②低黏度 流动相，流速不宜快； ③柱温适当。
分离含双键的化合物常用氰基键合相分离多基团化合物常用氨基正相键合相色谱的流动相通常采用烷烃加量极性调节剂极性调节剂常从组表183中选见课本390页若还难以达到所需要的分离选择性还可以使用三元或四元溶剂系统
高效液相色谱法分离条件的选择
第六组
• 一、高效液相色谱中的速率理论 • 二、分离条件的选择
一、高效液相色谱中的速率
1、涡流扩散
与气相色谱相同，涡流扩散项也是A=2λdp。一般为了降 低涡流扩散的影响，HPLC中一般使用3～10μm的小颗粒固 定相，为了填充均匀，减少不规则因子，常用球形固定相， 而且要求粒度均匀。此外，HPLC色谱柱以均浆高压填充。
2、纵向扩散
纵向扩散系数Ｂ=2γDm,而Dm与流动相的黏度（η）成 反比，与温度成正比。在HPLC中，流动相是液体，其黏度 比气体黏度大得多，而且常在室温下进行操作，因此组分 在流动相中的扩散系数Dm比气相色谱的要小得多。一般 HPLC的流速在最佳的流速，这时纵向扩散很小可以忽略。
• （二）反相键合相色谱法的分离条件 • 反相键合相色谱法中，常选用非极性键合相，非极性键 合相可用于分离分子型化合物，也可以用于分离离子型或 离子化的化合物。 • 在反相键合相色谱法中，流动相一般极性最强的水 为基础溶剂，加入甲醇、乙氰等极性调节剂。极性调节剂 的性质以及其与水的混合比例对混合溶质的保留值合分离 选择性有显著影响。同时调节流动相的离子强度也能改善 分离效果。例如在流动相中加入0.1%~1%的出酸盐、磷酸 盐等，可减弱固定表面相残余硅醇基的干扰作用，减少峰 的拖尾，改善分离效果。
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
液相色谱速率理论方程式
液相色谱速率理论方程式1、流动相的要求：高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐肯定要过滤；流动相脱气至关紧要（可采纳抽滤，超声波脱气等方法）2、吸滤头：特别情况下可拆下滤头抽取以判定其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判定其是否堵塞。
若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。
3、单向阀：如碰到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀显现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！4、泵头：泵头漏液或显现其它故障一般要申请维护和修理（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）5、过滤器：当色谱峰显现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。
6、排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。
7、手动进样器：平常应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如显现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维护和修理或更换配件。
8、流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。
可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可依据说明书进行操作或申请维护和修理）。
9、工作站：显现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。
液相色谱速率理论方程式在范第姆特方程模型基础上，依据液相色谱的特点作了某些修正，得到如下几种液相色谱速率理论方程式。
1、高效液相色谱速率理论方程式：其中涡流扩散项：分子扩散项：传质阻力项：其中包含：称为流动的流动相中传质阻力系数，称为滞留的流动相中的传质阻力系数，称为固定相中的传质阻力系数。
高效液相色谱速率理论方程认真表达式：式中，dp——色谱柱填料平均粒径；df——固定相有效液膜厚度；U——流动相平均流速；Dm——组分分子在流动相中的扩散系数；Ds——组分分子在固定相中的扩散系数；wm——由色谱柱和填充的性质所决议的系数；ws——与容量因子k有关的系数；wsm——与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子k有关的系数。
液相色谱速率理论方程式
液相色谱速率理论方程式液相色谱技术在分析化学领域广泛应用，它可以对分子间的相互作用进行分离和分析。
液相色谱在某些情况下可以获得比气相色谱更好的分离性能，它对于有机药物、天然产品、杂质和特定化合物的分析具有重要的应用价值。
在液相色谱技术中，速率方程是评估和优化分离的一个基本工具。
运动相中物质在离子交换、分配等作用下在固定相上分离的速率过程与化学反应通常是非常不同的，它们是一种不可逆的动态平衡状态。
液相色谱速率方程式可以用来描述某一个分离过程的运动特性，并根据这些运动特性和物理化学性质推导出一些数学方程来评估和优化分离过程。
液相色谱速率方程的特点是实验条件千差万别，影响因素很多，因此需要大量的实验数据和统计方法。
液相色谱分离的速度由固定相和流动相的物理化学特性共同决定。
在理论上，液相色谱分离的速度可以用一些数学公式计算，其中比较著名的有康托尔方程、范德沙方程、克罗默方程等。
康托尔方程是最早提出的液相色谱速率方程，它假设液相色谱分离过程是在局部热力学平衡状态下进行的。
康托尔方程可以用来评估物质在液相色谱柱中的速度和列效率。
康托尔方程参数的确定是通过实验来完成的，它包括相对体积、局部网架的功率函数、分离因子和颗粒尺寸等。
康托尔方程的主要缺陷是它不能估计非理想的杂质分离效应，以及在非平衡情况下的分离效果。
范德沙方程则超越了康托尔方程的限制，它用形式更加系统的方法来描述了液相色谱分离。
范德沙方程假设液相色谱分离过程是一种多段过程，每一个单元都有一定规律的质量传递速度。
范德沙方程可以处理各种白噪声和杂质分离问题，但它也存在着一些缺陷，如计算过程过于复杂，对复杂液相色谱分离的描述存在不足等。
克罗默方程则将范德沙方程进行了优化，它是目前使用最多的液相色谱速率方程。
克罗默方程是从范德沙方程发展而来的，它将范德沙方程的一些难以处理的部分进行了线性化简化。
克罗默方程能够准确地描述各种液相色谱分离現象，有效地解决了液相色谱分离过程中存在的问题。
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高效液相色谱速率理论
1956年荷兰学者van Deemter 等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论— 速率理论。
他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。
该理论模型对气相、液相色谱都适用。
式中：u 为流动相的线速度； A ， B ， C 为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数、传质阻力系数。
该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低 H ，从而提高柱效。
1、涡流扩散项A
在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“ 涡 流” 的 流动，故称涡流扩散。
Cu u
B A H ++=
从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，峰形展宽。
A ＝2 λdp
dp：填充物平均颗粒的直径 ;
λ：填充不均匀性因子
展宽程度以A表示
固定相颗粒越小 ( dp↓) ，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。
则由涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。
对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。
2、分子扩散项B /u（纵向扩散项）
纵向扩散是由浓度梯度造成的。
组分从柱口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状，如图所示。
它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。
分子扩散项系数为： B=2γD g
B：分子扩散项系数
γ：阻碍因子（扩散阻止系数） , 因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因素 - 弯曲因子
D ：组分在流动相中扩散系数
3、传质阻力项C u
由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。
（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即：
C＝Cg＋Cl
气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。
有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。
这样，使得试样在两相界面上
不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。
对于填充柱，气相传质阻力系数Cg 为：
式中k 为容量因子。
由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数见成反比。
因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可他Cg 减小，提高柱效。
液相传质阻力系数C1为：
由上式看出，固定相的液膜厚度df 薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。
降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k 值随之变小，又会使C1增大。
当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。
虽然提高柱温可增大Dl ，但会使k 值减小，为了保持适当的Cl 值，应控制适宜的柱温。
g p g d k k C 2
2
2)1(01.0∙+=g p g D d k k C 222)1(01.0∙+=l
f l D d k k C 22)1(32∙+∙=l f l D d k k C 22)1(32∙+∙=
将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程 。
气液色谱速率板高方程 :
这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。
（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数（C ）包含流动相传质阻力系数（Cm ）和固定相传质系数（Cs ），即：
C ＝Cm ＋Cs
其中Cm 又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即：
式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。
当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀. ωm 是由柱和填充的性质决定的因子。
ωsm 是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。
u D k kd D d k k u D d H l f
g p g p ])1(32)1(01.0[2222222++∙+++=γλm
p sm m p
m m D d D d C 22ωω+=m p sm m p m m D d D d C 22ωω+=
液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs ）可用下式表示：
液液色谱的 Van Deemter 方程式可表达为：
该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。
速率理论的要点
(1) 组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩散 、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到平衡等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。
(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。
(3) 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。
阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
(4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；s
f s s D d C 2ω=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωγλ+∙++=u D d D d D d u D d H s f s m p sm m p m m p )(22222ωωωγλ+∙++=
柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。