黑曲霉液体发酵制备_葡萄糖苷酶的研究_刘敏
一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法[发明专利]
![一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/91a099110242a8956aece473.png)
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专利名称：一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因及其高效表达方法 专利类型：发明专利 发明人：吴敬,刘旭,吴丹,陈坚 申请号：CN201310095971.4 申请日：20130322 公开号：CN10314 6726A 公开日：20130612
摘要：本发明公开了一种黑曲霉α-葡萄糖苷酶aglu及其在毕赤酵母中的高效表达方法。所述优化 的α-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列如SEQ ID No1所示。所述基因构建到毕赤酵母表达载体并与二硫键 异构酶基因转化入毕赤酵母中共表达，在3L罐上诱导110h后酶活达力可到10.1U/mL，是优化前的 2.9倍，可用于α-葡萄糖苷酶的工业化生产。
黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的研究
ｔｓｅ ａ ｂ ｎ ｓ ｕ ｃ ｓ Ｔ ｅ ｏ ｔ ｌ ｃ ｌ ｒ ｏ ｄｔ ｎ ｏ ｇｕ ｏ ｉａ ｅ ｐ ｅ ａ ａ ｉｎ ｂ ． ｎｇ ｒ ｉ ｕ ｍｅ ｇ ｄ ｆ ｒ ｎ ａｉｎ Ｗ ｅ ｔ ｄ ｃ ｒ ｏ ｏ ｒ ｅ ． ｈ ｐ ｉ ｕ ｔ ｅ ｃ ｎ ｉ ｏ ｆＢ—ｌ ｃ ｓｄ ｓ ｒ ｐ ｒ ｔ ｙ Ａ ｍａ ｕ ｉ ｏ ｉ ｅ ｎ ｓ ｂ ｒ ｅ ｅｍｅ ｔｔ ａ ｏ ｓ ４ ｄｕ ｉ ５ ｈ ｋ ａ ｋ ｈ ｏ ｕａ ｉｎ ｗａ ０ ｍＬ ｍｅ ｉ ｍ ｎ２ ０ ｍＬ ｓ ａ ｅ ｆ ｓ ，ｔ ｅ ｉ ｃ ｌｔ ｓ８％ ，ｔ ｅ ｉ ｉ ａ Ｈ ａｕ ａ ． ｌ ｎ ｏ ｈ ｎｔ ｌ ｉ ｐ ｖ ｅ ｗ ｓ５ ５，ｔ ｅ ｃ ｌ ｒ ｅ ｅ ａｕ ｅ ａ ｄ ｒ ｔ－ ｌ ｈ ｕｔ ｅ ｔｍｐ ｒ ｔ ｒ ｎ ｏａ ｕ ｔ ｎ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｕ ａｏ ｈ ｋ ｒｗｅｅ ３ ｎ ７ ｍｉ ｉ ｐ ｅ ｆＩ ｃ ｂ ｔｒＳ ａ ｅ ｒ ０ ｏ ａ ｄ １ ０ ｒ ｎ，ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｙ ｎ ｈ ｉｈ ｓ － ｌ ｅ ｓｄ ｓ ｃｉｉ ｆ １ １ Ｕ ｍＬ ｏ Ｃ ／ ｅ ｐ ｃ ｉ ｌ ，ａ ｄ ｔ ｅ ｈ ｇ ｅ ｔ ｇ ｕ ｏ ｉ ａ ｅ ａ ｔ ｔ ｏ ９． ２ Ｉ ／ ｖ ｖｙ
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黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产_葡萄糖苷酶的研究_刘小杰
黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究刘小杰(浙江大学食品科学与营养系,杭州310029)陶飞 童纪峰(杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州310018)摘要:本文研究了黑曲霉ZJ1发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件及β-葡萄糖苷酶的酶学性质。
结果表明:黑曲霉摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基组成为(g/L):稻草50,麦麸15,大麦粉15,(NH4)2SO410,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O0.5,起始pH5.0。
产酶条件为:培养温度28℃,转速为200r/min,当培养时间为144h,β-葡萄糖苷酶活性达到最大。
β-葡萄糖苷酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;β-葡萄糖苷酶的最适反应p H为5.5,在p H3.0～p H8.0之间较稳定;Zn2+、Al3+、Ca2+和Mn2+对β-葡萄糖苷酶酶促反应均有一定的促进作用。
关键词:黑曲霉,β-葡萄糖苷酶,稻草粉,发酵Study ofβ-Glucosidase Produced by As pe rgillus Niger ZJ1Liu Xiaojie(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou310029)Liu Xiaojie,Tao F ei,Tong Jifeng(R&D Department of Hangzhou Wahaha Group Company Limited,Hangzhou310018)A bstract:This paper studied the fermentation condition and properties ofβ_glucosidase b y As pergillius niger.Experimental re-sults demonstrated that cultivation medium composition was as follows(g/L):rice straw powder50,wheat bran15,barley flour 15,(NH4)2SO410,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O0.5,initial pH5.0.The maximumβ_glucosidase activity reached at28℃with RPM of200r/min when cultured144hours.β_glucosidase's optimum temperature was50℃,and it was stable under40℃.Its optimu m p H was5.5and it was stable in p H3.0～pH8.0.Metal cation influence enzyme activity,Zn2+、Al3+、Ca2+and Mn2+have active effects on enzyme activity.Key words:As pergillius nig er,β_glucosidase,Straw powder,Fermentation 目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种,大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株,虽然这些菌株能产生高活力的内切型及外切型葡聚糖酶,但不足之处在于β_葡萄糖苷酶产量很低。
黑曲霉产α- 葡萄糖转苷酶发酵条件的研究
代谢机理研究、食品成分分析和医学诊断 [7-8] 等方面。 经被啤酒同行所关注。
但目前国内生产 α- 葡萄转糖苷酶酶制剂厂家较少，
鉴于此，本文以啤酒酵母自溶物替代微生物发酵
其发酵周期较长，所耗的培养基量较多，酶的产量和 培养基中的酵母浸膏，研究其对黑曲霉发酵产酶的影
特性不易控制，因此对于 α- 葡萄糖转苷酶生产成本 响，为啤酒废酵母的综合利用提供更为直接和廉价的
α- 葡萄糖转苷酶主要是由黑曲霉（Aspergillus niger） 1 ～ 1.5 t 的啤酒废酵母（以干重计），啤酒废酵母若
发酵生产，目前已广泛应用于基础开发研究领域，主 直接排弃，必将产生环境污染，同时给企业5]、淀粉水解 [6]、酒精发酵、 损失 [9-10]。因此，利用啤酒废酵母开发高附加值产品已
（1）培养基。①菌种斜面培养基：察氏培养基。 ②种子及发酵培养基：葡萄糖 40 ～ 50 g/L、酵母膏 18 g/L、 磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、尿素2 g/L，pH 5.5 ～ 6.0， 根 据 不 同 的 实 验 设 计 要 求， 改 变 培 养 基 的 各 组 分。
③酵母自溶物的制备：取啤酒废酵母按质量比 1 ∶ 1 加水稀释后，添加 3% NaCl，调 pH 至 6.5，50 ℃条件 下自溶 48 h，取出后至沸水浴中灭酶 10 min，冰箱冷 藏保存待用。
食品科技 Food Science and Technology
ｄｏｉ：１０．１６７３６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｎ４１－１４３４／ｔｓ．２０１８．０５．０１８
黑曲霉产 α- 葡萄糖转苷酶发酵条件的研究
Study on the Fermentation Conditions for Producing α-Transglucosidase from Aspergillus Niger
黑曲霉产β-葡萄糖苷酶液体培养基研究
表明在 ２０ ｍ ５ Ｌ三角瓶装 ２ ｍ ５ Ｌ培养 、 接种种龄为 １ 的种子培养液 ２ ５ｍ 、 ｄ ． Ｌ ３ ２℃ 培养 ５ｄ 的培养条件下 ， 其液体发酵较适
产酶培养幕为（ Ｖ）： Ｗ／ 纤维素粉 ４ 、 ％ 硝酸钾 ３ 、 ％ 聚乙二醇 ０ １ 、 ． ％ 初始 ｐ Ｈ为 ６ ５ 这将 为 ｐ一葡 萄精计酶液 体发酵 的工 ．， Ｉ 化生产和应用提供参考价值。 ［ 中图分 类号］ Ｑ ３ ９６ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编 号］ ０ １－ ９ ６ ２ ０ ０ ０ ４ １０ ４ ２ （ ０７）４— ０ ９—０ ４
Ｉ ｐ ｉ ｌｃ ｍｐ ｓｔ ｎ ｏ ｕ ｔ ｒ ｄｕ ｆ ｒ ｅ ｚ ｍｅ ｓ ｃ ｅｉ ｎ ｂ ｉ ｕ ｄ—ｓａ ｅ ｆ ｒ ｎ ａｉ ｎ ｗ ｓ ｃ ｌ ｌｓ ｏ ｄ ｒ４ ，ＫＮ ％ ， ｔ ｏｔ ｓ ｍａ ｏ ｏ ｉ ｏ ｆｃ ｌ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ｏ ｎ ｙ ｅ ｒ ｔ ｙ ｌ ｉ ｉ ｕ ｏ ｑ ｔｔ ｅｍｅ ｔ ｔ ａ ｅ ｌ ｏ ｅ ｐ ｗ ｅ ％ ｏ ｕ Ｏ３３
于各种微生物中， 如细菌 、 菌等 ； 真 此外 ， 在动物中也发现该酶的存在 。ｐ一 葡萄糖苷酶水解 由内切葡聚糖酶 （ ｎ ｏ—Ｂ一１４一ｇ ｃ ． ｓｓ Ｅ ． ． ． ） ｅｄ ， １ ａ ａｅ ， Ｃ ３ ２ １４ 和纤 维二 糖水 解 酶 （ ｅ ｏ ｉ ｙｍｌｓｓ Ｅ ． ． ． １ 产 生 的纤 维 ． ｃｌ ｂｏ ｄ ａｅ ， Ｃ３ ２ １ ９ ） ｌ ｈ 二 糖 和低 分 子量 的纤 维 寡糖 ， 生成 葡 萄 糖 ， 纤 维 素 的分 解 过程 中起 重 要 的作 用 Ｊ 由于 内切 葡 聚糖 酶 和 在 。 纤维 二 糖水解 酶 受纤 维 二糖 的抑 制 ， Ｂ一葡 萄糖 苷 酶活 力 低 的纤 维 素 酶 有非 常 弱 的 糖化 能 力 。此 外 ， 含 ｐ一 葡 萄糖 苷酶也 能水 解 其 它有重 要 生理 作用 的 ｐ一葡萄 糖 苷 。 因此 ， ｐ一葡 萄 糖 苷 酶进 行 研 究 是 十分 必 要 对 的。到 目前为止 ， 对该酶的研究多 以木霉为主 。但木霉具有产酶慢 ， 酶系 比活力不高 ， 普遍存在 Ｂ一 葡萄糖 苷酶活力很低 的缺陷， 致使纤维二糖积累 ， 影响了酶解效率 。有人采用在木霉纤维素酶 中添加曲霉的 Ｂ一 Ｊ 葡萄 糖苷 酶 ， 极大 地提 高 了纤 维素 酶 的降解 能 力 ｊ 。在 从真 菌培 养 液 中筛选 Ｂ一葡萄糖 苷 酶 ， 发现 来 源于 黑 曲霉培养液的 Ｂ一 葡萄糖苷酶具有非常高的活性和稳定性 。基 于其独特的性质 ， Ｊ 一种简单期
用黑麴菌的液态酦酵生产葡萄糖酸ProductionofGluconicAcidby
發酵槽培養基： 3 公升培養基於 5 公升發酵槽中操作。
孢子的計算
圖1 圖2 圖3
製備孢子懸浮液，將 PDA 平板培養基做在 500 mL 三
32h
醱酵過程葡萄糖及葡萄糖酸濃度的變化（葡萄糖 150 g/L）
表1
五公升醱酵槽培養黑麴菌生產葡萄糖酸的結果
討論
兩種葡萄糖濃度的發酵結果沒有顯著差異。
表 1 的結果顯示有 6～7％的葡萄糖在醱酵過程轉變成細胞成分或
消耗成能量。
低濃度葡萄糖的生產速度（5.2 g / L・h）大於高濃度葡萄糖的生
接種 300 mL 的黑麴菌液態搖瓶培養液
設定發酵槽的攪拌速度為 600 rpm、溫度 30℃、通氣 1 取樣，加水稀釋 50~100 倍（因為形成葡萄糖酸鈣，溶
vvm、pH5.5 以下時自動饋入 20%的 Ca(OH)2 來調整。 解度很低），離心，用濾孔 0.2 μm 的針筒過濾器過濾， 用 HPLC 分析。
結果
葡萄糖酸和葡萄糖的 HPLC 分析
採用的 HPLC 分析是使用逆相層析管（Merck RP18e），移動相 Acetonitrile：water（30：70），流速： 0.5 mL / min。
3.27 min 2.70 min
圖4
葡萄糖、葡萄糖酸的 HPLC 層析圖
結果
菌絲形態
圖 6
產速度（4.8 g / L・h）。 其原因可能有二： （一）低濃度葡萄糖的滲透壓較低，有利於黴菌的生長 和代謝。
（二）低濃度葡萄糖的有利於氧氣的傳輸，葡萄糖轉變 成葡萄糖酸需要大量的氧氣，而高濃度葡萄糖是 比較不利於氧氣的傳輸。
黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究
黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究王维娜1，李佥1，田晶1，费旭2，徐龙权2，廉萌1(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)(2.大连工业大学现代教育技术部，辽宁大连 116034)摘要：本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。
将黑曲霉液态发酵所产酶液，依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。
经SDS-PAGE 凝胶电泳仅得到一条清晰条带，分子量约为65.10 ku 。
纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg ，纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%，并且能有效水解柚皮苷。
进一步研究发现，该酶的最适反应pH 为4.5，最适作用温度为50 ℃，在20 ~50 ℃℃及pH 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。
在一定浓度范围内，K +、Ca 2+和Na +对柚苷酶活性有促进作用，而Fe 3+、SDS 和EDTA-Na 2对其活性有明显的抑制作用。
本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程，明确其酶学性质，进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据，具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。
关键词：黑曲霉；液态发酵；柚苷酶；纯化；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)07-72-78 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.012Isolation, Purification, and Properties of Naringinase Produced fromAspergillus niger FFCC 848 by Liquid FermentationW ANG Wei-na 1, LI Qian 1, TIAN Jing 1, FEI Xu 2, XU Long-quan 2, LIAN Meng 1(1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China) (2.Modern Education Technical Department, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: The isolation, purification, and enzymatic properties of naringinase produced by liquid fermentation with Aspergillus niger FFCC 848 were investigated. The fermentation broth produced from liquid fermentation by A. niger FFCC 848 was purified by ammonium sulfate fractional precipitation, dialysis, and DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography to yield highly purified naringinase. Only one clear band was observed upon sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, with a molecular weight of 65.10 ku. The final, purified naringinase showed 13.82-fold purification, with an enzyme activity recovery of 13.30% and specific activity of 6932.54 U/mg, and the enzyme could effectively hydrolyze naringin. Furthermore, the activity of naringinase was stable at 20–50°C and pH 3.0–6.0; optimum activity was observed at 50°C and pH 4.5. In a specific concentration range, the enzyme activity was enhanced by K +, Ca 2+, and Na +, but was strongly inhibited by Fe 3+, SDS, and EDTA-Na 2. This study provides a basis for understanding the purification of naringinase and for further studies of the related mechanism underlying the bioconversion of bioactive natural products with naringinase.Key words: Aspergillus niger ; liquid fermentation; naringinase; purification; enzymatic properties柚苷酶（EC 3.2.1.40）是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，同时具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。
黑曲霉改良株C112产β-葡萄糖苷酶的诱导及条件优化
黑曲霉改良株C112产β-葡萄糖苷酶的诱导及条件优化先天敏;陈介南;张林【摘要】利用单因素实验及均匀设计法研究了黑曲霉C112发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件.结果表明:黑曲霉C112发酵产β-葡萄糖苷酶的影响因素很多,包括接种方式(菌株活力)、接种量、碳氮源种类与浓度、发酵温度时间、初始pH值等.研究发现,通过种子接种改善菌株活力能有效提高产酶活力.碳源粒径也是影响诱导产酶效果的重要条件之一,当玉米芯粒径高于0.180 mm时产酶效果最佳.该菌株最适宜产酶条件为:玉米芯与麦芽浸粉(7:3)6 g/L、初始pH值4.87、30℃下发酵120 h,所得酶活力最大可达12.925 U/mL,较优化前提高了79.0％.【期刊名称】《中南林业科技大学学报》【年(卷),期】2013(033)011【总页数】8页(P154-161)【关键词】黑曲霉;发酵β-葡萄糖苷酶;条件优化;麦芽浸粉【作者】先天敏;陈介南;张林【作者单位】中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004;中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004;中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研究中心,生物环境科学与技术研究所,湖南长沙410004【正文语种】中文【中图分类】S718.43;S718.52+1.3C112发酵产β- 葡萄糖苷酶的影响因素很多，包括接种方式(菌株活力)、接种量、碳氮源种类与浓度、发酵温度时间、初始pH值等。
研究发现，通过种子接种改善菌株活力能有效提高产酶活力。
碳源粒径也是影响诱导产酶效果的重要条件之一，当玉米芯粒径高于0.180 mm时产酶效果最佳。
该菌株最适宜产酶条件为：玉米芯与麦芽浸粉（7:3）6 g/L、初始pH值4.87、30 ℃下发酵120 h，所得酶活力最大可达12.925 U/mL，较优化前提高了79.0 %。
生物燃料乙醇可以替代石油等化石能源,是发展低碳经济的重要新能源[1]。
黑曲霉液态发酵产糖化酶条件的研究
３ ． Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ Ｓ ｏ ｌ ｉ ｄ － ｓ ｔ ａ ｔ ｅ ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｉ ｒ ｎ ｇ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｙ ｇ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｂ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ ， Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ３ ６ ８ ２ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ｌ ａ ｄ ｏ ｐ ｅ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅ ，２ ９℃ ｉ ｎ ｃ ｕ ｂ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ａｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇ ｅ ｒ ｃ ａ ｌ ｌ ｂ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｈｅ ｔ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｘ ｉ ｍｕ ｍ ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ａ ｍｙ ｌ ａ ｓ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ； ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ； ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ； ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ａ ｍｙ ｌ ａ ｓ ｅ
葡 萄糖 淀 粉 酶简 称 糖化 酶 ， 可 水 解 淀粉 、 糊精 、
黑 曲霉 。 １ ． １ ． ２ 实验 试剂 可 溶 性 淀粉 、 葡 萄糖 、 酵母 膏 、 琼脂 、 蛋 白胨 、 硫 酸铜 、 次 甲基蓝 、 亚铁 氰 化钾 、 氢 氧 化钠 、 硫 酸亚 铁 、
１ ． １ － ３实验 主要 仪 器 恒 温培 养箱 、 立 式 自动 电热压力 蒸 气灭 菌 锅 、 数
糖原等物质 ， 产物为葡萄糖 。 在工业发酵生产酒精、 有机酸 、 氨基酸等过程中淀粉液化后 的糖化酶作用
黑曲霉As.n.XEC-1液体发酵产β-葡萄糖苷酶条件及酶学性质研究
１ ２ 方 法 ．
１ ２ １ 种子 培养 方法 ： 面菌种 培养 是将 黑 曲霉 Ａｓ ＸＥ － ．． 斜 ． Ｃ １接在 试管 斜 面培养 基上 子培 养基 ： Ｄ 培 养基． ．． Ｐ Ａ
１ １４ 摇 瓶 发 酵培 养 基 （ ／ ０ ） 玉米 粉 ２ 麸 皮 ２ 谷 糠 ２ 黄 豆粉 ２ （ Ｏ ０ ５ ＫＨ Ｐ ０ ０ ， ．． ｇ １ ０ｍＬ ： ， ， ， ， ＮＨ ）Ｓ ． ， Ｏ ． ５
纤 维素 降解有 关 的酶 主要有 三种 ： 内切 葡 聚糖 苷 酶 （ Ｃ ． ． ． ） 外 切 葡 聚 糖 苷 酶 （ Ｃ ． ． ． １ 和 Ｅ ３ ２ １４ ， Ｅ ３２ １９ ）
葡 萄糖苷 酶 （ Ｃ ． ． ． １ ］ 在纤 维素 酶解 过 程 中 ， 维二 糖 是外 切 葡 聚糖 苷 酶 和 内切 葡 聚 糖苷 酶 的 强烈 Ｅ ３ ２ １２ ） ． 纤 抑 制剂 ， 纤维 二糖 的积 累能显 著 降低纤 维素 的水 解进 程 ， ］ 向纤维 素 水 解体 系 中添 加 葡 萄糖 苷 酶 ， 过将 通 纤 维二糖 转化 为葡 萄糖来 消 除这 种抑 制作用 ” ． 。 而 葡 萄糖 苷酶 即纤 维二 糖水 解酶 ， ］ 是纤 维素 酶 的重要组 成 部 分 ， 够协 助纤维 素酶 将纤 维素 水解 为葡 萄糖 ｌ ， 高纤 维 素酶 的降 解 能力 ， 已广泛 应 用 于食 品 、 造 、 能 ４提 ］ 现 酿 啤酒 、 动物 饲料 、 织干洗 、 浆造 纸 、 业 以及基 础科 学研 究 中 ， 纺 制 农 具有 很 高的应 用价 值 ． ］ 葡萄糖 苷 酶能将 水果 、 蔬菜 、 叶等 中 的一些 次级代 谢产 物—— 风味前 体 物 质 糖苷 水 解 为具 有浓 郁 茶 香气 的物 质 ， 因此 ， 萄糖 苷酶 可 以应 用 于果 汁饮 料 、 葡 果酒 酿 造 以及 茶 叶 的加工 中 ， 而将 潜 在 的香 气物 质 从 前体水 解 ， 释放 出香 气成分 ， 加食 品香气 ， 高产 品 的感官 质量 ． 葡 萄糖苷 酶 对大 部分 普 通 色素 具 有降 解 增 提 作用 ， 例如 可 以将 花青 素 降解 为糖和 花色 素 ， 因此将 葡 萄 糖苷 酶 用 于饮 料如 白葡 萄酒 的脱 色 ， 取得 较 好 的 效果 ． ］ 本研 究筛 选获得 了一株具 有 高 葡 萄糖 苷 酶活 力 的 菌 株 ， 其进 行 了发 酵 优 化 控 制及 酶 活 性 质研 对 究． 现将 研究 结果 报道 如下 ：
黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究
黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究常军;周斌;胡娜【摘要】[ Objective ] The study aimed to isolate the exocellular β-glucosidase from Aspergillus niger that could hydrolyze the swertiamarin and research its molecular weight, optimal catalytic temperature, optimal pH, stability and catalytic characteristics. [ Method ] The A. niger liquid was fermented for 3 d and then its culture liquid was collected. After the culture liquid was made through the salting out and column separation, a β-glucosidase was gained. [ Result] The β-glucosidase had the molecular weight of 86 kD, the optimal pH of 5.0 -6.0, the optimal reaction temperature of 50 -60 ℃ and showed stable at below 60 ℃. TheCa2+ ,Zn2+ , Fe3+ and Cu2+ could restrain the activity of the βglucosidase and the Mg2+ and Mn2+ could activate its activity. Cellobiose was the optimal catalytic substrate of β-glucosidase. [ Conclusion] This enzyme, similar to the most A. niger from the fungi, showed the weak affinity to the swertiamarin and the strong affinity to p-NPG.%[目的]分离能水解獐牙菜苦苷的胞外β-葡萄糖苷酶,并研究其分子量、最适催化温度、最适pH、稳定性及催化特征.[方法]黑曲霉液体发酵3 d,收集培养液,培养液经盐析、柱分离得到1个β-葡萄糖苷酶.[结果]该β-葡萄糖苷酶的分子量的86 kD,最适pH为5.0～6.0,最适反应温度为50～60℃,在60℃以下时酶稳定;Ca2+、Zn2+、Fe3+和Cu2+能抑制β-葡萄糖苷酶的活性,而Mg2+和Mn2+能够激活β-葡萄糖苷酶的活性;纤维二糖是该β-葡萄糖苷酶的最适催化底物.[结论]该酶和大多数真菌来源黑曲霉相似,对獐牙菜苦苷的亲和性弱,对p-NPG的亲和力强.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)019【总页数】4页(P11374-11376,11379)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;分离;纯化【作者】常军;周斌;胡娜【作者单位】江西科技师范学院生命科学学院,江西,南昌,330038;江西科技师范学院药学院,江西,南昌,330038;江西科技师范学院生命科学学院,江西,南昌,330038【正文语种】中文【中图分类】S188β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.2.21)又称β-D-葡萄糖苷酶，属于纤维素酶类。
黑曲霉_葡萄糖甘酶的提纯与性质
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2期
宛晓春等 :黑曲霉ρ- 葡萄糖甘酶的提纯与性质
157
表 2 黑曲霉 M83 - 3325β- 葡萄糖苷酶氨基酸组成 Table 2 The Amino acid composition ofβ- glucosidases from A . niger and almond
β- 葡萄糖苷酶 ( EC. 3. 2. 1. 21) 能水解纤维二糖 ,也能水解生物体内的β- 葡萄糖苷 , 因而有重要的价值 。近年来有关水果[1～4 ] ,茶叶[5 ]中香气物质的研究表明 :香气物质 ,特 别是萜烯醇类除了游离的挥发性部分外 ,还大量以无香味非挥发性的香气物前体 ———糖 苷的形式存在 ,这些潜在的香气物质在水果 、茶叶的成熟和加工过程被β葡萄糖苷酶水解 而释放出来 。笔者筛选产β- 葡萄糖苷酶的一黑曲霉菌株 ,对该酶进行分离纯化 ,获电泳 纯酶 ,并对酶的一些性质进行了研究 。
图 2 Sephadex G - 100 凝胶色谱图 Fig. 2 Gel filtration ofβ- glucosidase on
Sephadex G - 100 - - - - - 蛋白质 Proteins ; ———β- 葡萄糖苷酶活
β- glucosidase activit y.
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1 材料和方法
1. 1 菌种 产酶菌种黑曲霉 Aspergill us niger v. Tiegh. 为实验室选育[6 ] 。 1. 2 主要化学试剂 Sephadex G - 25 , G - 100 , DEA E - Sephadex A - 50 , 均为 Pharmacia 公司产品 。三羟基氨基甲烷 ( Tris) 为 Merck 公司产品 。胃蛋白酶 、β- 葡萄糖苷酶 、过氧化氢酶及对硝基苯酚 - β- 葡萄糖苷 (pN P G) 均为 Sigma 公司产品 。低分子量标准蛋白 (用于 SDS - 凝胶电泳) 为上海生化所东风生化试剂厂产品 。 1. 3 方法 1. 3. 1 菌的发酵培养见前文[6 ] ,发酵液经离心抽滤 ,得粗酶液 ,用于酶的分离纯化 。 1. 3. 2 酶活力测定 :见前文[6 ] 。 1. 3. 3 蛋白质测定接 Lowry[7 ]的方法进行 。 1. 3. 4 盐析 :在搅拌条件下 ,缓慢地向粗酶液中加入 (N H4) 2 SO4 粉末至 35 %饱和度 ,静置过夜 ,离心分 离 (4000r/ min , 30min) ,弃去上清液 ,收集沉淀 。 1. 3. 5 脱盐 :将盐析收集的沉淀用少量 0. 05mol/ L Tris - HCl 缓冲液 (0. 1mol/ L 的 NaCl) 溶解 ,酶液上
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究
黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究李晓东;周明;杨丽娜;夏伟;王俊;钱利纯【摘要】研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量.研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku.β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】5页(P14-18)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;酶学特性【作者】李晓东;周明;杨丽娜;夏伟;王俊;钱利纯【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036;安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058;浙江大学动物科学学院,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】Q93;Q814β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.2;beta-glucosidase)属于水解酶类，是纤维素酶系中的一种，能水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖。
Liebig等(1837)首次在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，其后发现β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界许多植物中。
Bongon［1］、Masaru 等［2］、Elias等［3］、汪大受［4］分别从苦杏仁、葡萄、大豆、玉米、黑樱桃、水稻和大豆中分离纯化了β-葡萄糖苷酶。
黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质
黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质刘中美;谢梦圆;周哲敏【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2015(034)011【摘要】“绿色资源”纤维素广泛应用于能源、医药、食品等领域,β-葡萄糖苷酶(BGL)作为纤维素降解酶系的限速酶是当前研究热点之一.作者对黑曲霉利用豆渣发酵所产的胞外β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,并对该酶进行了酶学性质表征.实验结果表明,BGL最适反应温度为55℃,最适反应pH为2.0～2.5,pH稳定范围为2.0～7.5.在最适反应条件下,Km值为8.4×10-4 mol/L,kcat为16 s-1,催化效率kcat/Km为1.92×104 L/(mmol·s).相比较其他报道的BGL酶,该酶具有更好的耐酸性能,可为BGL的理论研究与酶制剂的生产应用提供一定基础.【总页数】5页(P1198-1202)【作者】刘中美;谢梦圆;周哲敏【作者单位】江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q55【相关文献】1.黑曲霉变种RM48 α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究 [J], 许尧兴;李艳丽;柳永;许少春;姚晓红2.黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 常军;周斌;胡娜3.黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究 [J], 徐星;肖华;黄琳琳;别松涛4.黑曲霉CICIM F0410中α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 [J], 周敏;王正祥5.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 郭金玲;陈程鹏;周一郎;陈红吉;吕育财;任立伟;龚大春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究
黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究刘小杰;陶飞;童纪峰【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2004(000)003【摘要】本文研究了黑曲霉ZJ1发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件及β-葡萄糖苷酶的酶学性质.结果表明:黑曲霉摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基组成为(g/L):稻草50,麦麸15,大麦粉15,(NH4)2SO4 10, KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,起始pH 5.0.产酶条件为:培养温度28℃,转速为200r/min,当培养时间为144h,β-葡萄糖苷酶活性达到最大.β-葡萄糖苷酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;β-葡萄糖苷酶的最适反应pH为5.5,在pH 3.0～pH 8.0之间较稳定;Zn2+、Al3+、Ca2+ 和Mn2+ 对β-葡萄糖苷酶酶促反应均有一定的促进作用.【总页数】5页(P27-31)【作者】刘小杰;陶飞;童纪峰【作者单位】浙江大学食品科学与营养系,杭州,310029;杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州,310018;杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州,310018【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.航天诱变黑曲霉ZM-8菌株固态发酵产β-葡萄糖苷酶的研究 [J], 刘星斌;张宗舟;蔺海明;马旭光2.β-葡萄糖苷酶产生菌摇瓶发酵条件的研究 [J], 朱凤妹;杜彬;刘长江;李军3.黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵条件的研究 [J], 赵子高;吕世峰;杨付伟;闫振丽;王林凤4.产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究 [J], 张谦;贾佳;林智;杨晓锋;郭宏涛;王剑英;Carol Sze Ki Lin5.伞枝梨头霉产β-葡萄糖苷酶液体摇瓶发酵条件研究 [J], 胡宜亮;郝益民;刘德海;庞向宇;孙晨阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第42卷第5期2008年9月生 物 质 化 学 工 程B iomass Che m ical Eng i n eeringV o.l 42N o .5Sep .2008黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究收稿日期:2008-02-20基金项目:国家自然科学基金(30471361),江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJ A22015) 作者简介:刘敏(1981-),女,江苏徐州人,硕士生,主要从事生物质资源生物降解与转化的研究*通讯作者:勇强,教授,博士生导师,主要从事生物质资源生物降解与转化和制浆造纸生物技术研究。
刘敏,欧阳嘉,勇强*,余世袁(南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘 要:研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。
麸皮是黑曲霉B -葡萄糖苷酶的较适诱导物。
黑曲霉NL02以40g /L 麸皮为碳源,在250mL 三角瓶中装液40mL,接种量8%,初始p H 值5.5,30e 、170r /m in 下培养10d ,B -葡萄糖苷酶活力为19.12I U /mL 。
B -葡萄糖苷酶最适温度为65e ,40e 时稳定性较好;最适p H 值为4.8,在p H 值3.0~5.0之间稳定性较好。
关键词:黑曲霉;B -葡萄糖苷酶;麸皮中图分类号:TQ91;Q 55 文献标识码:A 文章编号:1673-5854(2008)05-0005-04Preparati on of B -G l ucosi dase by A s p er gillus ni ger i n Sub merged Fer m entati onL IU M i n ,OUYANG-Jia ,YONG Q iang ,YU Sh-i yuan(Co ll ege of Chem ical Eng i neeri ng ,N anji ng F orestry U niversity ,N anji ng 210037,Ch i na)Abstrac t :The effects o f culture cond iti on on B -g lucosidase prepara ti on by A sp ergillus ni ger i n sub m erged fer m en tati on and the apparen t enzym ati c properties of B -g l ucosi dase we re i nvestigated .W heat bran w as the opti m a l i nducer o f B -g l ucosi dase a m ong tested carbon sources .T he opti m al culture cond iti on o f B -g l ucosi dase preparati on by A.n i ger i n subme rged fer m entati on w as 40mL m edi u m i n 250mL shake fl ask ,the i nocu lati on w as 8%,the i nitial p H value w as 5.5,t he culture te m perature and rota -ti on speed of Incuba t o r Shaker w ere 30eand 170r /m in ,respecti ve l y ,and the h i ghest B -g lucosidase acti v ity of 19.12I U /mLw as ob tained for 10days culti v ati on .The opti m a l te m perature and p H va l ue o f B -g l uco si dase reac ti on w as 65e and 4.8,respec -ti ve l y .The B -g l ucos i dase was stab l e unde r 40eand i n t he env iron m ent p H value o f 3.0-5.0.K ey word s :A spergilli us ni ger ;B -g lucosidase ;wheat branB -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是纤维素酶系的主要组分,其在纤维素水解过程中的作用是将纤维素经内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)作用产生的纤维低聚糖和纤维二糖水解成葡萄糖[1]。
除了纤维素糖化外,B -葡萄糖苷酶还广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织、造纸和农业等领域[2]。
虽然自然界中大多数能够分泌纤维素酶的微生物也能合成B -葡萄糖苷酶,但不同的微生物合成B -葡萄糖苷酶的能力有差异。
黑曲霉(A s pergillus niger )是较好的B -葡萄糖苷酶生产菌株,本文作者研究了培养条件对黑曲霉NL02液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的影响及B -葡萄糖苷酶的表观酶学性质。
1 实验1.1 菌种黑曲霉(A s p ergillus ni g er )NL02,由南京林业大学生物化工研究所保藏。
1.2 材料麸皮,收集于江苏省徐州市,粉碎至0.20~0.28mm;玉米芯、玉米秸秆,收集于江苏省盐城市,粉碎至0.20~0.28mm;硫酸盐纸浆,南京林业大学制浆造纸工程研究所提供;羧甲基纤维素,由上海国药集团提供。
1.3 培养基斜面培养基:PDA 培养基。
种子培养基:6生物质化学工程第42卷M andels培养基[3]。
发酵培养基:麸皮40g/L, (NH4)2SO44g/L,KH2PO43g/L,M gSO4#7H2O0.4g/L,C a C l20.5g/L。
1.4种子制备一定量的种子培养基置于250m L带棉塞的三角瓶中,于121e、30m in灭菌冷却后接入黑曲霉孢子,于170r/m i n、30e下培养48h后获得菌丝体种子液。
1.5B-葡萄糖苷酶的制备一定体积的产酶培养基置于250mL带棉塞的三角瓶中,接种量分别为6%、8%、10%、15%、20%、25%和30%(体积分数),于170r/m in、30e的恒温摇床上培养10d,培养液于3000r/m in下离心10m in得到粗酶液。
1.6最适pH值及酸碱稳定性的测定分别用不同pH值缓冲液配制的对硝基苯基-B-D-葡萄糖苷(pNPG)溶液为底物,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。
取适量的B-葡萄糖苷酶液,与一定体积的p H值为3.0~8.0的缓冲溶液混合后于50e下处理2h,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。
1.7最适温度及热稳定性的测定在55~75e范围内,按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以最高酶活力的相对百分数表示。
取适量的B-葡萄糖苷酶液在pH值4.8,温度分别为40、50、60e下保温3h,每隔30m i n 取样按标准方法测定B-葡萄糖苷酶活力,酶活力以原酶活力的相对百分数表示。
1.8分析方法还原物的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[4],B-葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力按国际标准方法测定[4-5]。
2结果与讨论2.1碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用B-葡萄糖苷酶属于诱导酶类,其生物合成受到诱导调节控制,碳源通常是酶合成的诱导物质。
不同碳源对黑曲霉NL02合成B-葡萄糖苷酶的诱导作用如图1。
图1不同碳源对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.1Th e effec t of carbon sources on the prep ara-tion of B-g l ucosidase由图1可知,不同碳源诱导黑曲霉合成B-葡萄糖苷酶的能力不同,麸皮对B-葡萄糖苷酶的诱导作用最强。
黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源时,B-葡萄糖苷酶活力达到6.00I U/mL,而以相同浓度的玉米芯为碳源,B-葡萄糖苷酶活力仅为2.61I U/mL。
从图1还可看出,随着原料中纤维素聚合度的增加,碳源对B-葡萄糖苷酶的诱导作用逐步降低,说明低聚合度的纤维素对B-葡萄糖苷酶的诱导作用较强。
当碳源为聚合度较高的硫酸盐纸浆和羧甲基纤维素时,B-葡萄糖苷酶活力仅为0.26和0.22I U/mL。
2.2培养条件对B-葡萄糖苷酶合成的影响2.2.1初始p H值的影响黑曲霉NL02以40g/L的麸皮为碳源,培养基初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响如图2。
由图2可知,培养基初始p H值为5.5时B-葡萄糖苷酶活力最高,达6.18I U/mL,高于或低于最适pH值,酶活力都呈下降趋势。
图2初始pH值对B-葡萄糖苷酶合成的影响F i g.2Th e effect of i n iti al p H val ue on th e prep ara-tion of B-g l ucosi dase第5期刘敏,等:黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶的研究72.2.2 接种量的影响 接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图3。
由图3可知,在较低接种量时,酶活力随着接种量的增加而增加,当接种量为8%时酶活力达到最高值5.73I U /mL ,之后随着接种量的增加,酶活力呈下降趋势,当接种量为30%时,B -葡萄糖苷酶活力仅为1.91I U /m L 。
图3 接种量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .3 The effect of i nocu lation a m ount on thepreparation of B -glucosidase2.2.3 装液量的影响 黑曲霉NL02在250mL 三角瓶中分别装液30、40、50、60和70m L ,初始p H 值为5.5的培养基,接种量为10%,于30e 、170r /m in 下培养,装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响如图4。
装液量在一定程度上反映氧的供应,在相同摇瓶体积下,装液量越小,氧的供应则越大。
由图4可知,在250mL 的三角瓶中装液量为40mL 时,B -葡萄糖苷酶活力最高,达到11.29I U /mL 。
当装液量超过40mL 时,溶氧状况变差,酶活力迅速下降,当装液量提高到70mL 时,B -葡萄糖苷酶活力仅为3.46I U /m L。
图4 装液量对B -葡萄糖苷酶合成的影响Fig .4 The effect of m ed i um ch arge on th epreparation of B -glucosidase2.3 黑曲霉液体发酵制备B -葡萄糖苷酶历程在250mL 三角瓶中,黑曲霉以40g /L 麸皮为碳源,在装液量40mL 、初始pH 值5.5、接种量8%、30e 、170r/m i n 下培养,培养过程中B -葡萄糖苷酶活力、滤纸酶活力随时间的变化如图5。