EB病毒检测技术进展及临床应用

EBV实验室检测方法
嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在EBV还未 确定为IM的病因之前，1932年引入临床实践诊断IM。 当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。 该抗体在病程第1～2周出现，持续约6个月。 在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达80％-90％，约10％ 的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。
1975年Horwitz首次描述一些持续性IM患者血清存在高滴 度的抗EBV-VCA和EA抗体
1982年Tobi进一步描述并证实该病 1984年被称为慢性单核细胞增多样综合征 1986年被定义为慢性症状性EBV感染 1991年被称为慢性活动性EBV感染
CAEBV
发生于儿童或年轻成年人 该病表现为慢性或反复的单核细胞增多样症：发热、肝脾
概述
➢ 传播途径：EBV感染主要通过唾液接触传播，也可通过 血液传播；
➢ 人感染EBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%。 ➢ 1-6岁儿童、14-20岁青少年及年轻成年人高度易感，发
展中国家EBV感染多发生在儿童早期。
病原学
疱疹病毒科，γ疱疹病毒亚科，淋 巴隐病毒属，人疱疹病毒4型
球形双链DNA病毒，基因组平均 大小约为172 kb
EBV病毒核酸检测
➢ 实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV载 量的方法
➢ 鉴别EBV健康携带者的低水平复制与EBV相关 疾病患者高水平活动性感染。
EBV病毒核酸检测
EBV载量检测有多种方法，Real-time PCR是 目前最主要的监测EBV载量的方法，有较强的敏 感性和特异性。不同的EBV疾病进行Real-time PCR检测时，需要的标本不同。
EB病毒检测技术及临床应用
概述
Epstein-Barr病毒（EBV）
➢ 疱疹病毒科，γ亚科，嗜淋巴细胞病毒属， ➢ 1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织
培养中发现。 ➢ EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤
相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种 肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。
EBV潜伏感染的细胞含有大量的EBERl／EBER2 （EBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病 毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBV潜伏 感染的细胞含有大约106拷贝EBERS，被认为EBV潜伏感染 的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERS是诊 断肿瘤是否EBV相关的金标准
－ ＋ ＋/－ 低＋/－ 高＋
－ － ＋/－ ＋ ＋/－
临床需要回答的问题
➢ 是否感染EBV? ➢ EBV感染的时相？ ➢ 是否EBV活动性感染？ ➢ 疾病是否与EBV感染相关？
EBV实验室检测方法
➢ 病毒培养 ➢ 免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术） ➢ 血清学方法（ELISA法，化学发光法） ➢ 基因诊断技术
潜伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：
• 在感染B细胞表面，与细胞恶化有关，
未翻译的转录物BARF0和EBER EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTL CD8+的主要目标
原发性EBV感染过程中首先产生针对 衣壳抗原（capsid antigen, VCA） IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗 早期抗原（early antigen, EA）抗体 出现在恢复期晚期，抗核抗原 （nuclear antigen, NA）抗体产生， 抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持续终身
原位杂交：检测出EBER-1阳性细胞 Southern杂交：受累组织或外周血中检测出
EBV DNA 免疫荧光：检测到抗原（EBNA、LMP） 感染的B、T、NK细胞、单核/巨噬/组织细胞
检测到EBNA、EBER、EBV-DNA
EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症 EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH
➢ 特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征 ➢ 1889年被首次描述为“glandular fever” ➢ 1920年正式定义为IM ➢ 1932年发现嗜异性凝集实验 ➢ 1968年实验室工作人员感染EBV，出现IM临床症状和嗜
异性凝集抗体，明确EBV是IM的病原
IM临床表现
25-30%的青少年和<30岁的成年人原发感染EBV后表现IM 儿童时期EBV感染多为亚临床型或不典型症状 临床症状：发热、淋巴结肿大、扁桃体炎（灰白色渗出）、咽炎、肝
抗EA-IgG在发病后3-4周后升高， 3~4月后检测不到
抗EBNA-1-IgG在发病后3~4周被检 测到，持续终身，部分慢性EBV感 染者检测不到
抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG终生持 续阳性
EBV常见相关疾病
传染性单核细胞增多症(IM) infectious mononucleosis
膜抗原（MA）： • 细胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)，是EBV的中和性 抗原 • 抗MA-IgM可用于早期诊断
EBV感染的抗原表达
EBV潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及：
核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：
• 为DNA结合蛋白，在感染的B细胞核内； • EBNA-1与感染有关，EBNA-2与细胞转化和永生化有关； • EBNA抗体出现在感染晚期。
EBV致病机制
➢ EBV在人体B细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原 （包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、 EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受 感染者将成为终身带毒者。
➢ 在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以 被再激活，引起病毒复制及临床疾病。
➢ Burkitts淋巴瘤 何奇金淋巴瘤
EBV感染的抗原表达
EBV溶解性感染期，可表达：
早期抗原（EA）： • EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）； • EA出现表明EBV活跃增殖，EA抗体出现在感染早期；
衣壳蛋白（VCA） • 晚期表达的结构蛋白 • VCA-IgM出现在急性感染早期，VCA-IgG出现在急性感染期并 持续存在
肿大、持续性肝炎、广泛性淋巴结肿大 EBV感染的NK和T细胞克隆扩增在CAEBV具有重要意义 通常是一种肿瘤前状态或者与严重免疫缺陷有关，可进一
步引起EBV相关的T/NK细胞增殖性疾病 预后差，病死率高
CAEBV的诊断标准
1）持续性或反复发作的IM样症状 2）异常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG
EBV常见相关疾病
➢ 传染性单核细胞增多症 （Infectious mononucleosis,IM)
➢ 慢性活动性EB病毒感染 （Chronic active EBVinfection，CAEBV）
➢ EB病毒相关性嗜血细胞综合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS)
作用机制
作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制
EBV感染的实验室诊断
外周血分类
淋巴细胞≥50% WBC 不典型淋巴细胞≥10% WBC（系激活的CD8+ CTL）
血清学检查
嗜异性凝集实验（heterophile test/spot test） VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG
EBV致病机制
➢ 原发EBV感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖， 然后感染附近的B淋巴细胞，受到感染的B淋巴细胞进 入血液循环可以造成全身性感染。
➢ EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以 下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青 春期和青年期 ，约50%的原发性感染均表现为IM。
EBV感染的血清学诊断评价
嗜异性抗体（heterophile antibody，HA）凝集实验 （“spot” test）
嗜异性抗体（IgM）在发病后7天内出现，2-5周达高峰，可以持 续6-12个月，偶有12个月后以低水平存在
HA阳性提示原发急性感染，EBV再激活感染几乎阴性 阳性率：青少年和成年人71%-90%， 2-5岁儿童50% 假阴性：发病第1周内假阴性率25%，10%成人始终阴性 假阳性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、HAV肝
Hydroavacciniforme 牛痘样水疱
hypersensitivity to mosquito bites
CAEBV的诊断标准(1)
临床症状
持续性或反复发作的IM样症状
• 发热、淋巴结肿大、肝脾肿大
并发症：
• 血液系统（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板减少、贫血） • 消化系统（肝功能衰竭、消化道溃疡） • 中枢神经系统 • 间质性肺炎 • 心血管（冠状动脉瘤、心肌炎、心瓣膜病） • 皮肤（蚊虫叮咬过敏、皮肤牛痘样水疱 ）
抗EBV病毒药物
无环核苷拟似剂 acyclovir（阿昔洛韦），ED50 0.3µΜ ganciclovir（更昔洛韦）， ED50 0.05µΜ
valaciclovir（缬昔洛韦 ）
无环核苷酸
cidofovir，adefovir
焦磷酸盐 拟似剂
foscarnet（磷甲酸钠）
和/或受累组织包括外周血检测到EBV基因组 3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解释
Okana M, et al. Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection. America J Hematol.2005,80:64-69
CAEBV的诊断标准(2)
血清抗体滴度异常升高
抗VCA-IgG≥1:640和抗EA-IgG≥1:160 抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈阳性
受累组织和外周血检测到EBV-DNA、RNA、 有关抗原和克隆
PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量 >102.5copies/µg
脾肿大、眼睑水肿和皮疹、上腭粘膜出血点 皮疹经常发生于使用氨苄西林、阿莫西林和一些β内酰胺类抗生素1
周后，发生率90% 并发症：粒细胞减少、血小板减少、脾破裂、扁桃体肥大致气道阻塞
、暴发性肝炎、溶血性贫血、再生障碍性贫血、中枢神经系统疾病
慢性活动性EBV感染, CAEBV chronic active EBV infection
EBV感染的血清学诊断
传统检测策略的问题
5%新近EBV感染不出现CA-IgM抗体
在罕见的病例中抗CAIgM会持续存在
约20-30%的新近感染不出现EAIgG抗体
抗EBNA-IgG抗体可能呈现阴性，由于： - 慢性活动性EBV感染 - 细胞免疫被抑制
EBV感染的血清学诊断
抗VCA-IgM和IgG可以同时出现，通 常IgG出现较IgM晚，但偶尔较IgM 出现早1~2周，抗VCA-IgM几周后检 测不到
是一种与EBV感 EBV感染所致CD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞
因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLH的主 要病例生理特征 临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DIC，骨髓和其他 组织见嗜血细胞、LDH、铁蛋白、β微球蛋白 EBV-HLH常见于儿童和青少年
病毒学标志
在PBMC、血清、全血或感染组织检测EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP
EBV感染疾病的血清学诊断
诊断 既往无感染 IM (急性期) IM（恢复期） 既往感染 慢性活动性感染
VCA IgM VCA IgG EA IgG EBNA IgG
－ ＋ ＋/－ － ＋/－
－ ＋ ＋ ＋ 高＋
炎
化学发光技术
❖ 优点 敏感性高 特异性强 操作简便
❖ 缺点 需要硬件设备 成本昂贵
胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶 胶，氯金酸在还原剂的作用下， 聚合成特定大小的金颗粒，并 由于静电作用成为一种稳定的 胶体状态
简便，快捷，敏感度和特 异度较差
EBV实验室检测方法
EBERS原位杂交试验