第8章-荧光免疫试验PPT课件
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
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3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器授课PPT
PART 03
荧光免疫技术详解
荧光免疫技术原理
或抗体结合，形成荧光标记 的抗原或抗体。
激发与发射荧光
在特定波长的光激发下，荧光标记物发出特定波长的荧光，通过检 测荧光信号实现对抗原或抗体的定量或定性分析。
信号放大
荧光免疫技术常采用信号放大方法，以提高检测灵敏度。常见的信 号放大方法包括酶标记、化学发光标记和量子点等。
对化学发光与荧光免疫技术进行比较，分 析各自的优缺点，并展望未来发展趋势和 挑战。
PART 02
化学发光技术基础
化学发光原理
化学发光是指物质在化学反应过程中吸收反应释放的能量，并以光子的形式释放出 来。这个过程不需要外部光源激发，因此被称为化学发光。
化学发光反应通常可以分为两类：一类是直接化学发光，反应过程中直接产生光子 ；另一类是能量转移化学发光，涉及两个或多个反应物之间的能量转移。
，为临床诊断和治疗提供有力支持。
荧光免疫技术在病毒与细菌检测中的应用
总结词
高分辨率、可视化结果、快速检测
详细描述
荧光免疫技术利用荧光物质标记抗体或抗原 ，通过荧光信号的强弱判断目标物质的含量 。该技术具有高分辨率和可视化结果的特点 ，能够快速检测病毒和细菌等微生物，为感 染性疾病的诊断和治疗提供重要依据。
课程内容概述
化学发光技术及其仪器
荧光免疫技术及其仪器
介绍化学发光技术的基本原理、发光标记 物、发光反应体系以及常见的化学发光分 析仪器。
探讨荧光免疫技术的基本原理、荧光标记 物、荧光反应体系以及常见的荧光免疫分 析仪器。
临床应用实例
技术比较与展望
通过实际案例分析，介绍化学发光与荧光 免疫技术在临床检验中的应用，包括传染 病检测、肿瘤标志物检测、激素检测等。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
医学免疫学检验免疫荧光技术课件
成本较高
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
离心
抗体溶液
②透析法：蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） 最大吸收光谱: 565nm 。 最大发射光谱: 575nm 。 荧光颜色: 橙色。 应用：
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。 最大发射光谱: 520-530nm 。 荧光颜色: 黄绿色。 应用最广：
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
离心
抗体溶液
②透析法：蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） 最大吸收光谱: 565nm 。 最大发射光谱: 575nm 。 荧光颜色: 橙色。 应用：
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。 最大发射光谱: 520-530nm 。 荧光颜色: 黄绿色。 应用最广：
临床免疫学和免疫检验荧光免疫技术讲义
第八章荧光免疫技术第一节概述荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。
一、荧光的基本知识1.荧光：荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。
2.发射光谱：发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。
激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。
荧光物质在吸收光能后，即刻发射荧光，一旦停止供能，荧光随即消失。
3.激发光谱：激发光谱是指固定检测发射光荧光波长，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光发射强度谱图。
4.荧光效率；在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。
5.荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。
6.荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、1-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
7.荧光偏振。
二、荧光物质（一）荧光色素1.异硫氰酸荧光素（FITC）:为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。
分子量为389.4kD, 最大吸收光波长为490〜495nm，最大发射光波长为520〜530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
其主要优点是:①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。
2.四乙基罗丹明（RB200）：不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595〜600nm，呈橘红色荧光。
3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。
4.藻红蛋白（R-RE）：最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm,呈明亮的橙色荧光。
（二）其他荧光物质1.镧系螯合物：其中以致3+应用最广。
EU3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。
荧光免疫试验
3.标本片需保持湿润，避免干燥
4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。 +：荧光较弱但清楚可见。 ++ ：荧光明亮。 +++：耀眼强荧光。 特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈或±。 根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
第三节 流式荧光免疫试验
与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理 特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
间接荧光抗体染色法示意图
间接免疫荧光法示意图
间接法：
优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原
既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光
5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素
作用下，发射荧光减弱甚至消退称为
荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯
胺、酚、硝基苯、I 等
。
荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
（二）荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
时间分辨荧光免疫测定
5.信号增强
酸性增强液
结合β-二酮体
Eu3+标记 抗原抗体 复合物
Eu3+ 解离
荧光 增强
时间分辨荧光免疫测定
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。 悬浮阵列；流式微球阵列
第08章 荧光免疫试验
第一章 血液标本采集与处理
临床免疫学检验技术
第八章 荧光免疫试验
毛旭虎
目 录
第一节 荧光免疫试验的组成要素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其它与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
第一节
荧光免疫试验的组成要素
重点提示
二、荧光偏振免疫试验
1.基本原理
荧光偏振免疫试验原理示意图
荧光偏振免疫试验
2.方法评价：
荧光偏振免疫试验样品用量少；
荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；
方法重复性好；
快速，易于自动化；
试剂盒专属性强；
通常适用于检测小分子到中等分子抗原物质，不适宜
于测定大分子抗原物质。
第五节
荧光免疫试验的临床应用
本章小结
流式荧光免疫试验是一种采用人工微球（胶乳颗粒） 和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法 。 多功能多指标并行分析技术，或悬浮阵列。 流式微球阵列技术。
本章小结
时间分辨荧光免疫试验是以镧系元素标记抗原或抗体 ，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非 放射性微量分析技术。Eu3+是最常用于时间分辨荧光免疫试 验测定的标记物。 荧光偏振免疫试验是利用抗原抗体反应原理。荧光物 质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，吸收光能跃迁进 入激发态，随后回复至基态，并发出另一单一平面的偏振
荧光免疫试验的临床应用
一、间接荧光免疫试验： 血清中自身抗体的检测 各种微生物的快速检查和鉴定 寄生虫感染的诊断 白细胞分化抗原的检测 人类白细胞抗原的检测 肿瘤组织中肿瘤标志物的检测 激素和酶的组织定位
荧光免疫试验的临床应用
临床免疫学检验技术
第八章 荧光免疫试验
毛旭虎
目 录
第一节 荧光免疫试验的组成要素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其它与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
第一节
荧光免疫试验的组成要素
重点提示
二、荧光偏振免疫试验
1.基本原理
荧光偏振免疫试验原理示意图
荧光偏振免疫试验
2.方法评价：
荧光偏振免疫试验样品用量少；
荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；
方法重复性好；
快速，易于自动化；
试剂盒专属性强；
通常适用于检测小分子到中等分子抗原物质，不适宜
于测定大分子抗原物质。
第五节
荧光免疫试验的临床应用
本章小结
流式荧光免疫试验是一种采用人工微球（胶乳颗粒） 和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法 。 多功能多指标并行分析技术，或悬浮阵列。 流式微球阵列技术。
本章小结
时间分辨荧光免疫试验是以镧系元素标记抗原或抗体 ，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非 放射性微量分析技术。Eu3+是最常用于时间分辨荧光免疫试 验测定的标记物。 荧光偏振免疫试验是利用抗原抗体反应原理。荧光物 质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，吸收光能跃迁进 入激发态，随后回复至基态，并发出另一单一平面的偏振
荧光免疫试验的临床应用
一、间接荧光免疫试验： 血清中自身抗体的检测 各种微生物的快速检查和鉴定 寄生虫感染的诊断 白细胞分化抗原的检测 人类白细胞抗原的检测 肿瘤组织中肿瘤标志物的检测 激素和酶的组织定位
荧光免疫试验的临床应用
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
荧光免疫标记技术ppt课件
讨论分析
荧光FITC+RB200标志
讨论分析
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯、 卤素灯
滤板：隔热滤板、激光 滤板〔UG、BG〕、 吸收滤板〔OG、GG〕
光路：透射光、落射光
讨论分析
a 透射光
b 落射光
讨论分析
荧光显微镜台式机---FACSCalibur
双激光--488nm
635nm 四荧光参 数 分选、浓 缩系统
实验操作
【操作方法】
❖ 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 标志。
❖ 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 加样器加50μl待检血清或对照血清于基质片上，程度置 于湿盒中37oC温箱反响30min。
❖ 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 中，反复漂洗3次，每次5min。
性诊断 寄生虫检验---间接法测Ab,如抗疟Ab 、阿米巴Ab等 本身Ab检测
考核
配分与评分规范
序号
考核要点
分值
评分标准
1 (1) 抗原基质片，平衡 1 不符合要求将此分扣除
至室温
(2) 记号笔画圈标记
1
得分
2
(1) 待检血清和对照血 清用PBS作1∶10稀
1
不符合要求将此分扣除
释
(2) 微量加样器50μl待检
讨论分析
免疫荧光技术- 根本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反响的特异性 和敏感性与显微示踪的准确性相结合。
以荧光素作为标志物，与知的抗体(或抗 原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧 光素标志的抗体作为规范试剂，用于检测和 鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接察看呈现特 异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。
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-
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时间分辨荧光免疫测定
3.发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏 度高
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时间分辨荧光免疫测定
4.荧光标记物的相对比活性 比活性 ：单位时间内每个标记分子 可被探测到的信号量。
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一、时间分辨荧光免疫测定
（一）基本原理
1.时间分辨
➢自发荧光寿命短:1ns～10ns
➢镧系元素寿命长:10μs～
1000μs
➢短寿命荧光完全衰变后再测定
镧系元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
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时间分辨荧光免疫测定
2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波 长差。 stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光 谱和发射光谱不重叠
基态
吸收能量
激发态
荧光效率
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5
荧光特点：
1 可产生荧光的分子或原子在接受 能量后即刻引起发光；
2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消 失；
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一 荧光及荧光物质基础知识
(一)荧光的基本知识 1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同 波长下记录到的标本发射荧光的谱图。
2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用
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第二节 间接免疫荧光试验
一、基本原理
特异性抗体与相 应抗原反应，荧 光素标记的抗抗 体再与第一抗体 结合。
间接荧光抗体染色法示意图
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间接免疫荧光法- 示意图
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间接法：
优点：敏感度高于直接法
制备一种荧光抗体可检测多种抗原
既可用于检测抗原，也可检测抗体
缺点：易出现非特异性荧光
方法较麻烦
第八章
荧光免疫试验
Fluoroimmunoassay
齐齐哈尔医学院免疫教研室
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1
教学目的
掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色 与结果判断。
熟悉：荧光物质。
了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的
基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫
技术的应用。
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2
第一节 荧光免疫试验的组成因素 第二节 间接免疫荧光试验 第三节 流式荧光免疫试验 第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验 第五节 荧光免疫试验的临床应用 第六节 影响荧光免疫试验的主要因素
490560nm
354nm
Eu3+螯合物
340nm
595nm （红色） 430nm （蓝色） 613nm
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双标记FAT、流式 细胞术
双标记或多标记 FAT
时间分辨荧光免疫 测定
12
二、荧光显微镜
荧光显微镜
利用一定波长的激发
光对待测标本进行激发，
产生一定波长的荧光，
对组织细胞结构或其组
分进行定性、定位和半
3.标本片需保持湿润，避免干燥
4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本 上
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荧光抗体染色及结果判断
-：无或仅见极微弱荧光。
+：荧光较弱但清楚可见。
++ ：荧光明亮。
+++：耀眼强荧光。
特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-
或±。
根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
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第三节 流式荧光免疫试验
操作时间较长
应用：自身抗体的检测
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二、实验方法
标本片上滴加特异性抗体 37℃30min PBS洗涤 滴加二抗
37℃30min PBS洗涤 镜检
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三、注意事项
1.荧光染色时间：一小时内或2~8℃保存4小时，
2.三种对照：①阳对：阳性血清+荧光标记物
②阴对：阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
不同波长的激发光照射标品得到的荧光
的谱图。
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7
3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率 ------荧光效率
激发光强度及激发光波长
决定于
发射荧光的光量子数（荧光强度）
荧光效率 ＝
吸收光的光量子数（激发光强度）
决定于
荧光色素本身的物理特性
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8
4.荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生
的荧光衰减到一定程度时所用的
本下经聚光器透过标本
进入物镜。
落射光：照明光线从标
本上经垂直照明器落射
到标本，经标本反射进
入物镜。
透射荧光显微镜光路 落射荧光显微镜光路
- (a)
(b)
15
-
16
-
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三、荧光素-抗体结合物
1、抗体要求
高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG
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2 荧光素要求
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团 ❖荧光效率高， ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):
采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行 高通量分析的检测方法。
悬浮阵列；流式微球阵列
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第四节
其他与荧光检测相关的免疫试验
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其他荧光免疫试验
时间分辨荧光免疫测定 荧光偏振免疫测定 荧光酶免疫测定
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3
荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):
以荧光物质标记抗体和抗原，通过与 相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以 此对待测物进行定位、定性和定量分析的 检测技术，具有高度特异性、敏感性和直 观性，是最早出现的免疫标记技术。
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4
第一节 荧光免疫试验的组成要素
荧光物质吸收激发光的能量后， 电子从基态跃迁到激发态，当其回 复至基态时，以发射光形式释放出 能量，称为荧光。
时间。
➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
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5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素 作用下，发射荧光减弱甚至消退称为 荧光淬灭。 如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯 胺、酚、硝基苯、I-等 。
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荧光淬灭
如何避免： 勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存
猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质
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（二）荧光物质
定量分析检测。
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滤光片
荧光显微镜
隔热滤光片： 位于灯室聚光器前，
作用阻断红外线通过而隔热。
激发滤光片： 位于光源和物镜之间，
作用能选择性地透过紫外线可
见波长的光域，提供合适的激发光。
吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间，
作用阻断激发光而使发射的荧
光透过，保护眼睛。
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光路
荧光显微镜透ຫໍສະໝຸດ 光：照明光线从标荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 四乙基罗丹明 (RB200)
最大吸收 光谱
490～ 495nm
570～ 575nm
最大发射光谱
520～530nm （黄绿色） 595～600nm （橙红色）
应用
FAT、荧光偏振免 疫测定 FITC的衬比染色或 双标记FAT
藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素