大肠杆菌表达系统详细表格

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大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统
P tac = 3 P trp = 11 P lac
启动子
-35 区序列
-10 区序列
P lac
T T T A C A
T A T A A T
P trp
T T G A C A
T T A A C T
P tac
T T G A C A
T A T A A T
P traA
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lac、tac 表达系统存在的问题 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后,均能使 lac 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度(30℃)时抑制,在较高温度(42℃)时开放。 用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖,异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化,其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用,较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来,才能显示其良好的前景。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下, lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白,与启动 子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。
lacI Plac lacO lacZ lacY lacA
T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶,因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
T7 RNA 聚合酶基因

基因工程3大肠杆菌表达系统课件

基因工程3大肠杆菌表达系统课件
定性。 具有核糖体结合位点; 具有强启动子;
……
基因工程3大肠杆菌表达、大肠杆菌表达载体的基本成分
RBS
R
P
编码序列
TT
tetr
Ori
TT-G35ACA。。。17。。TA-1T0AAT
ATG(91%) GTG(8%) TTG(1%)
TAAGGAGG(N)8
TAA TGA TAG
此外,转录终止子还能增强mRNA分子的稳 定性,从而大大提高蛋白质产物的水平。
基因工程3大肠杆菌表达系统
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(3)翻译起始序列
mRNA转录本5’端的独特的结构特征(核 糖体结合位点,RBS),是决定mRNA翻译效 率的主要因素。
至今,仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构,但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方 法,从而提高克隆的外源基因的表达效率。
(3)加入适量的DNA后,于42 ℃热处理90秒;
(4)将混合物快速转移到冰浴中,是细胞冷却1-2分钟, 加入适当的培养基在37 ℃培养45分钟,使细胞复苏,并表
达质粒所携带的转化基因;
(5)选择培养基培养,选择转化体。
基因工程3大肠杆菌表达系统
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2、Hanahan转化法
1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞 的诱导方面,除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定 形式组合方式处理细胞外,还利用二甲亚砜 (DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)和氯化六氨合高钴 等进一步处理细胞,其它方面与上法相同。
在大肠杆菌细胞质内,若蛋白质N-端为Arg、 Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基,则其稳定 性较差;而同样条件下,若N-端为除了前述6 种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时, 其稳定性则大大提高。

1-大肠杆菌表达体系介绍PPT课件

1-大肠杆菌表达体系介绍PPT课件

转录水平 翻译水平
质粒拷贝数
.
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启动子
启动子 P lac P trp P tac P traA P lL P recA
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA TAGACA TTGACA TTGATA
P tac = 3 P trp = 11 P lac
.
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
酸性国内国外均 有,中性国内尚 未产业化
稳步增长
稳步增长,当前是纺织 酶中市场最大
宽温宽pH 碱性条件 近中性
国外有,国内目 前江南大学产业 化初步阶段
稳步增长 >3000吨
诺维信等少数国 际公司产业化, 国内产业化初步 阶段
市场空间较大 > 5000吨
目前尚无商业化, 未来皂洗、染料废水脱
成本高
色市场空间大
易操作性
• 转化,筛选、遗传稳定
可延展性
• 蛋白种类,放大
低成本性
• 发酵原料,发酵工艺和后处理
高效表达
• 副产物少,表达量高
.
11
常用工业酶表达系统的表达水平
种类 细菌 酵母
丝状真菌
菌名
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌
毕赤酵母 黑曲霉 米曲霉
里氏木霉 金孢子菌C1
表达水平
目的蛋白
总蛋白
<7g/l
20g/l
Aspergillus niger/oryzae
.
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表达系统
工业生产:菌株、发酵工艺和后提取方法等
The good production strain is not everything, but everything is nothing without a good production strain.

基因工程3大肠杆菌表达系统

基因工程3大肠杆菌表达系统

生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 (Bacillus thuringiensis),该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用,可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因,可以获得具有催化活性的酶,用
安全性问题
针对安全性问题,应加强监管和规范操作,确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染,应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产,并采取有效的检 测手段,确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用,用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物, 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因,可以获得具有生物活性的蛋 白质,用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景,可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔,可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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大肠杆菌及菌落总数

大肠杆菌及菌落总数

所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数,所用的方法是稀释平板计数法,由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit,cfu)数,故其单位应是cfu/g(mL)。

它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群,是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法。

多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长。

滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。

(三)实验器材(1) 菌落总数的测定:1)培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏3.0 g 蛋白胨10.0g NaCl 5.0g 水1000mL pH7.4~7.6 将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中,牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后到入烧杯。

也可放在称量杯中,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片。

在上述烧杯中先假如少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,加入琼脂,再在石棉上加热使其溶解。

将药品完全溶解后,补充水到所需的总体积。

在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用PH试纸测其PH,直至PH达7.6。

反之,用1mol/LHCL 进行调节。

无菌生理盐水:需用生理盐水浓度是0.9%:称取0.9克氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到100毫升。

2)器材试剂:牛肉膏蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水高压蒸气灭菌锅培养皿三角烧瓶带玻璃塞瓶天平试管牛角匙pH试纸(pH5.5-9.0)棉花记号笔纱布吸管麻绳牛皮纸量筒玻璃棒电热炉称量杯灭菌三角瓶灭菌的具塞三角瓶灭菌平皿灭菌吸管灭菌试管高压蒸气灭菌:1.将内层锅去处,再向外层锅中加入适量的水,使水面与三角架相平为宜。

大肠杆菌表达系统课件

大肠杆菌表达系统课件

THANKS
感谢观看
3
使用表达优化后的载体,提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略, 降低蛋白表达速度,促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白,促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子,提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一:高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高,纯度高 案例二:实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法,确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作,避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据, 学会分析和解读实验结果 ,培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件,提高纯化效果。

基因工程3大肠杆菌表达系统

基因工程3大肠杆菌表达系统

3、电转化法
电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的 时间和DNA浓度等参数的影响。 转化效率:108-109转化体/µ g DNA。
• 当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致 50%-70%细菌死亡时,转化效率达到最高。
• 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。
当细菌长到对数中期,冷却、离心,然后用 冷却的去离子水反复清洗,最后用10%甘油重 悬细胞,使其浓度为31010细胞/毫升,在干冰 或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。 • 转化必须在0-4 ℃下进行。 如果在室温下操作,转化效率会大大降低。
(4)分子伴侣(molecular chaperone)稳定作用
分子伴侣:指一类多功能蛋白质,它能够通过阻 止诸如聚合作用这样的副反应,来促使其它蛋白 质按正确的方式折叠,而其本身却不是最终形成 的功能蛋白质的组成成分。 通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌 寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、 实现高水平表达的有效方法。
mRNA转录本5’端的独特的结构特征(核糖 体结合位点,RBS),是决定mRNA翻译效率 的主要因素。
至今,仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构,但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法, 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量;诱发特异碱基 发生定点突变;以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
6)对目标蛋白质作疏水性修饰。
(2)结构决定因子与蛋白质的稳定性
• 与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征?
不清楚
• 但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结 构决定因子。
其中最重要的:N-端氨基酸性质。
N-端氨基酸性质

基因表达系统—大肠杆菌的定义

基因表达系统—大肠杆菌的定义
at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞, 用50 ml of Buffer A洗细胞,室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中,分装成0.2 ml于灭菌
的管中, 每管加 11 μl DMSO(-70度) ,混匀,液氮 快速冷冻, -70°C保存。
1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体
胞外表达载体
P. pastoris没有稳定的附加体质粒基,因表所达以系一统—般大用肠杆整菌合的型定义载体作为外源基因的表达载体
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
酵母表达系统
优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 4 快速
基因表达系统—大肠杆菌的定义
酵母细胞结构
基因表达系统—大肠杆菌的定义
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统
Saccharomyces cerevisiae 过去常用
毕赤酵母
Pichia pastoris 现在多用
基因表达系统—大肠杆菌的定义
单交换
同源重组基因转移法 :是将外源基因定位导人受体细胞染色体 上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一 或双交换,新基因片段可替换原有基因片段。
基因表达系统—大肠杆菌的定义
pAO815和pPIC9K 在Bgl
5 AOX1
II双切:
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换,替换
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine(N-二 羟乙基甘氨酸 ), pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )

大肠杆菌基因表达系统

大肠杆菌基因表达系统

必须用cDNA或者是化学合成的基因。 外源基因不能带有内含子。
除了具备克隆载体具备的条件外,还应具备以下条件: 强启动子、强转录终止子 可诱导性 合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等
理想原核表达载体具备的基本特征
1
2
5
4
3
A dividing E. coli
原核或噬菌体启动子
MCS
SD序列
终止子
条件:
组成结构:
必须选择一个有lacI的宿主菌。
tac P
Lac O
S导物: IPTG(乳糖的类似物,不会被降解)
阻遏物
IPTG
2.分泌型表达载体
如:pIN III系列: 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起,可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-A1, pIN III-A2, pIN III-A3,
EcoR I
BamH I
凝血酶
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
EcoR I
BamH I
Xa因子
pGEX-3X的插入区:
Sma I
Sma I
其他融合蛋白系统
His-tag能与Ni2+柱结合,但很容易被EDTA(或咪唑溶液)洗脱下来,可以纯化蛋白质。
细胞质
外膜
内膜
周间质
质粒
染色体
“外排”: 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”: 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
01
碱性氨基酸
Leu、Ile
Arg、Lys
02
N
04
疏水氨基酸核心区
07
AlaGlySer

大肠杆菌表达系统详细表格课件

大肠杆菌表达系统详细表格课件

整合载体
整合载体的特点
整合载体可将外源基因整合到宿 主细胞的染色体上,实现稳定遗
传。
应用范围
整合载体适用于基因治疗、基因 组编辑等领域,可提高外源基因
在宿主细胞内的稳定性。
注意事项
整合载体的构建需谨慎选择整合 位点,以避免对宿主细胞基因组
造成不良影响。
噬菌体载体
噬菌体载体的特点
噬菌体载体利用噬菌体感染宿主细胞,将外源基 因表达于噬菌体表面。
宿主菌的基因改造与优化
01
02
03
04
基因敲除
去除不必要或有害的基因,提 高表达效率和稳定性。
基因定点突变
通过改变基因序列以改良宿主 菌的某些特性,如提高蛋白表
达量。
基因融会与串联
将多个基因串联或融会,以实 现多蛋白表达或增加蛋白表达
量。
质粒优化
改进质粒复制、拷贝数和稳定 性,提高重组蛋白的表达水平
感谢观看

2023
PART 04
大肠杆菌表达系统的载体 选择与构建
REPORTING
质粒载体
质粒载体的特点
注意事项
质粒载体是大肠杆菌表达系统中常用 的载体类型,具有自我复制能力强、 拷贝数高等特点。
质粒载体的构建需考虑选择合适的复 制子、挑选标记以及多克隆位点等要 素。
应用范围
质粒载体适用于克隆中到大型基因以 及基因簇,并能在宿主细胞内进行高 拷贝复制。
REPORTING
定义与特点
定义
大肠杆菌表达系统是一种利用大肠杆 菌作为宿主细胞,通过基因工程技术 将外源基因在宿主细胞内进行表达的 生物反应体系。
特点
大肠杆菌表达系统具有生长速度快、 培养成本低、易于工业化生产等优点 ,广泛应用于基因工程药物、酶制剂 、生物材料等的研发和生产。

大肠菌群计数含MPN表

大肠菌群计数含MPN表

大肠菌群计数是一种估计悬浮在水溶液中活菌数的方法。

一般分几组进行,每一组各有数重复,分别以渐次的方式加入不同量的待测水溶液于培养液中进行培养,随后观察每一组中的试管是否有菌生长,然后再利用统计表估计菌数。

例如水中coliform数的测定,将待测水溶液以10ml,1ml及的量分别加入各组,每组三重复,经培养后观察coliform是否有生长,统计有菌生长的管数,以统计表统计菌数。

活菌的浓度可利用MPN的方式来估计,方式简单,可分为下列两步骤:在培养基中作数个重复稀释;记录有菌生长的试管。

若试管中无生长,则可能代表连一支菌都没有生长。

从统计观点,MPN这个方法是一种非常没效率的方式,因为每一试管与培养皿表面生长的菌数只有很小部分符合。

然而MPN的好处有以下:若菌无法长在固态培养基时,便可使用;若菌的生长的动力学具有很大变化,便可使用:假设某些菌会会立即且迅速的生长,且会在固态培养基产生很大的菌落,且与我们要的菌落接触到或盖过时;因为较少且具高度游动性或快速生长的菌,可能形成小菌落,因而其数量是很多而导致无法计数;假如非我们所要菌存在,或无筛选的方法存在时,便可使用。

虽然有污染的细菌可以大量生长,但仍可藉由我们所要看的菌产生特定的产物来估计;假如琼脂或其他固化材料有某些因素会干扰我们计数时,便可使用大肠菌群MPN表正反应试管数MPN/ml ( g )95% 信赖界线下限上限000< 30013< 590103< 513020---1004< 5201017121110712311111336120113362009136201143372101534421120789220214472212810150230---30023412030139713030264153803104372103117514230312120303803209315380321153044032221035470330240361,300331460712,4003321,1001504,800333> 1,100> 150> 4,800说明:若稀释倍数为10,100,1000倍(即每ml LST中,, ml(g)之检体),且LST均产气(正反应试管数3-3-3),经接种至EC,而其产气试管数为3-1-0,对照MPN为43,即为该检体大肠杆菌MPN数为43/ml (g)。

大肠杆菌表达系统详细表格PPT共37页

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大肠杆菌表达系统详细表格
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一, 也是成 功的利 器之一 。没有 它,天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ,徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿.丘吉 尔。 30、我奋斗,所以我快乐。--格林有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会,使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首,不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功,谁就会和我一样成功。——莫扎特

大肠杆菌表达系统详细表格共37页文档

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66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做,明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定一个人的一生,以及整个命运 的,只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
1、不要轻言放弃,否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人,常是愿意 去做,并愿意去冒险的人。“稳妥”之船,从未能从岸边走远。-戴尔.卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡,喝起来是苦涩的,回味起来却有 久久不会退去的余香。
大肠杆菌表达系统详细表格 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美,我宁愿选择无悔,不管来生多么美丽,我不愿失 去今生对你的记忆,我不求天长地久的美景,我只要生生世世的轮 回里有你。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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T7表达系统
大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录 体系,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统 称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合 酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高 活性的RNA聚合酶,合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚 合酶快5倍,并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合 酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7 噬箘体启动子的情况下,大肠杆菌宿主本身基因的转 录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动 子控制的基因的转录能达到很高的水平。
1) 克隆基因的mRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点 的存在,而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间 配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如 果相关的序列是由E. coli序列组成,可以避免这一可能性。
2) 在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞 降解。
3) 细菌片段可能含有信号肽,引导重组蛋白运输到胞外。 如ompA或者malE基因,这样重组蛋白可以被输出到细胞外,进 入培养基或者质膜空间。可以简化重组蛋白从培养物中纯化。
5
启动子
核糖体结合位点 复制起点
转录终止子
6
常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
7
Lac启动子的表达载体
lac启动子:控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因 转录的序列,可以被IPTG所诱导,所以加入诱导物 后,可以诱导启动子下游的外源基因的表达。
26
大肠杆菌表达外源基因的优势
• 全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架 • 基因克隆表达系统成熟完善 • 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 • 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
27
大肠杆菌表达外源基因的劣势
• 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 • 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 • 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异
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pPLc24表达载体: 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。
这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密 码子,不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表 达。
在MS2-聚合酶基因下游,存在BamHI和HindIII 单切点。EcoRI单切点靠近λ PL启动子,处于转译起 始密码子之前。
32
b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基
因,很难在大肠杆菌转化子细胞中得到有效 的表达。
不同生物密码子的偏爱性,是阻碍外源 基因在大肠杆菌中高效表达的一种重要因素。
33
5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率 的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养 方式、培养温度等环境因素能影响大肠 杆菌生理状态。
24
3. 宿主细胞
在大肠杆菌细胞内表达目的基因的主要 优势:一个是宿主的遗传背景比较清楚,易于 控制基因的表达;另一个是大肠杆菌容易培养, 可以获得较高产量的目的蛋白。但是在商业 应用中很多的蛋白产物是真核基因编码,并且 具有高级的三、四级结构,要求翻译后加工为 正确的折叠形式或者糖基化蛋白等。由于大 肠杆菌细胞的分子环境和折叠机制等与真核 细胞具有很大的差异,所以在应用大肠杆菌系 统表达真核基因时有必要利用代谢工程或进 化的方法改造细胞,解决大肠杆菌表达系统的 局限性,提高产物的活性。
4
4>. 转译起始序列 5’-末端结构特征,决定mRNA的转译起始效
率。 5>. 转译增强子
显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效 率。 6>. 转译终止子
mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA,尤其是在 其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下,转 译终止的效率便会得到进一步的增强。
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优点: 1. 蛋白质的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白质种类少,因此目标蛋
白容易纯化 3. 增进了蛋白质的折叠作用 4. 蛋白质N-末端的结构真实
缺点: 1. 在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白质,通
常是不会分泌到胞外培养基中去的 2. 由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释,因 此目标蛋白质的纯化过程比较复杂
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4.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性
几乎在所有的简并密码子家族中,都有一个 或两个是优先使用的偏爱性密码子;
一些密码子在各种不同基因中都是最常用的 (在编码脯氨酸4种同义密码子,CCC是优先 使用的)
高表达活性的基因比低表达活性的基因,呈 现出较高程度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率,反应它们相应的tRN A丰度。
1. 大肠杆菌染色体DNA的5.4kb HindIII 片断, 含 有trp启动子、操纵单元、前导序列、弱化子、 trpE基 因、 trpD基因的部分序列。
2. 将此片断,克隆到pBR322质粒的HindIII 位点, 构建成了ptrpED3表达载体(含有两个HindIII 位点)。
3. HindIII部分酶切消化,将靠近EcoR1位点的一个 HindIII 位点,经核酸外切酶和S1核酸酶处理,消除掉 构建新的质粒载体ptrpED5-1.
4) 细菌片段可以通过亲合色谱法辅助重组蛋白的提取。例 如与E. coli 谷胱甘肽-S-转移酶融合的蛋白可以吸附到含有结 合谷胱甘肽的琼脂糖柱上。
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2.外源基因在大肠杆菌细胞中的表达
• 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 • 融合蛋白质的表达 • 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性
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2.1 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位
影响 当mRNA分子5’-末端与SD序列之间的长度小于1
5bp时,转译效率下降。
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2. 质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影 响 a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响
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3.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影 响 a. 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基,T或A时转译作 用较高,C或G时,下降50%或25%; 位于起始密码子AUG上游的密பைடு நூலகம்三联体 的碱基,CUU或UAU时转译效率最有效,UUC、 UCA或AGG时下降20倍; 位于起始密码子AUG下游的密码子碱基 组成,也影响转译的速率。 b. mRNA的稳定性对表达效率的影响
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PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启
动子之一. λPL启动子:是负责λ DNA分子 转录的启动子之一。λPL启动子是可以被 E. coli RNA聚合酶所识别的强启动子,转而 转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产 物所抑制。携带λPL启动子的载体使用温度 敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下, 突变体所产生的cI蛋白可以抑制 λPL启动子, 在较高的温度下,蛋白失活可以导致克隆基 因的转录。
a. 目标蛋白质的纯化比较简单 b. 蛋白质酶解的程度不甚严重 c. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用(氧化 环境) 缺点: a. 信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 b. 有可能形成包涵体
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3>.胞外表达: 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质,分
泌到胞外培养基中进行分离纯化。 途径:
1. 用大肠杆菌细胞固有的途径,使真正属于分泌型 的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。(不是特别有效 的程序) 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏,导致 胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。(可以分离到 中等产量的蛋白质)
理论上,凡是具有包括控制区段在内的lac操 纵子的质粒,都基本上具备了用作克隆基因表达载 体的条件。这类表达载体的最突出的特点是,含有 一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。 因此,每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个 启动子之后,仍保持着lacZ基因固有的读码结构时, 这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码 的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质.
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质粒的构建: 将含有lac启动子的HaeIII 酶切片断,经平末
端连接,克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填 补修复的pBR322质粒上。
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Trp启动子的表达载体
色氨酸启动子可以被色氨酸抑制,也可以很容易的 被3-β-吲哚丙烯酸诱导。这种表达载体的优点是,它 所合成的蛋白质产量高于lac启动子表达载体系统,并 且是诱导型的。 构建:
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4.大肠杆菌表达系统研究的新 进展
近几年来,国内外大肠杆菌表达系统研 究的重点已从构建各种表达载体,建立新的 表达系统转移到完善现有的表达系统,解决 表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究 工作主要包括重组蛋白质的正确折叠,构象 形成和分泌,菌体表面表达技术及其应用, 重组蛋白质修饰加工研究等内容。
缺点: a. 折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b. 蛋白质的终产量偏低 c. 蛋白质的生产成本比较昂贵 d. 蛋白质种类多,因此纯化比较复杂
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2>. 周质中表达: 周质:在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中,位于内
膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白,需要信号肽序列才能从细
胞质中穿过细胞质内膜进入周质。 优点:
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大肠杆菌表达系统
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1.大肠杆菌表达体系的组成
一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有 表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表 达系统的性能和对各类外源基因的适应能力, 表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒 或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功 发展了许多表达载体和相应的宿主菌。
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Cassettes和基因融合 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子,而且需要
E. coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中,这些表达 信号组成一个cassette。
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