土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
碱性磷酸酶活性测定
碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
碱性磷酸酶测定方法(磷酸苯二钠比色法)
磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。
试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。
土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。
基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。
应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。
当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。
因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。
这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。
该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
土壤酶类检测
土壤酶类检测土壤酶参与土壤中各种生物化学过程，如腐殖质的分解与合成；动植残体和微生物残体的分解，及其合成有机化合物的水解与转化；某些无机化合物的氧化、还原反应。
土壤酶的活性大致反映了某一种土壤生态状况下生物化学过程的相对强度；测定相应土壤酶的活性，可间接了解某种物质在土壤中的转化情况。
不同植烟模式对土壤酶类物质活性的影响迪信泰检测平台采用生化法，可实现高效、精准的检测多种土壤酶类物质。
目前可检测的土壤酶类物质包括土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤纤维素酶和土壤脱氢酶等。
此外，迪信泰检测平台还提供土壤酶类生化试剂盒产品，以满足您的不同需求。
迪信泰检测平台可检测土壤酶类项目土壤脲酶(UE)活性检测土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测土壤过氧化氢酶(S-CAT)活性检测土壤酸性磷酸酶(S-ACP) 活性检测土壤碱性磷酸酶(S-AKP/ALP) 活性检测土壤中性磷酸酶(S-NP)活性检测土壤脱氢酶(SDHA)活性检测土壤纤维素酶(S-CL)活性检测土壤硝酸还原酶(S-NR)活性检测土壤亚硝酸还原酶活性检测土壤多酚氧化酶(PPO)活性检测β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测土壤α-葡萄糖苷酶(S-α-GC) 活性检测土壤碱性蛋白酶活性检测土壤中性蛋白酶活性检测土壤酸性蛋白酶活性检测土壤过氧化物酶(S-POD)活性检测土壤淀粉酶活性检测土壤几丁质酶活性检测土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(SNAG)活性检测土壤亮氨酸氨基肽酶(S-LAP) 活性检测土壤酸性转化酶(S-AI) 活性检测土壤漆酶活性检测土壤木质素过氧化物酶(S-LiP) 活性检测土壤锰过氧化物酶(S-Mnp) 活性检测土壤谷氨酰胺酶(S-GLS) 活性检测土壤芳基硫酸酯酶(S-ASF) 活性检测FDA水解酶活性检测土壤中性木聚糖酶(NEX)/土壤中性半纤维素酶活性检测土壤酸性木聚糖酶(ACX)/土壤酸性半纤维素酶活性检测土壤碱性木聚糖酶(BAX)/土壤碱性半纤维素酶活性检测土壤植酸酶活性检测土壤羟胺还原酶(HR)活性检测生化法测定土壤酶类样本要求：1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL，测定样品不返还，请您保留备份。
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）pH5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）14.8ml A + 35.2ml B混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
土壤酸性磷酸酶活性测定
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）pH5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）14.8ml A + 35.2ml B混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。
土壤酶的测定方法
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法一、土壤蔗糖酶3，5- 二硝基水杨酸比色法：1、试剂的配制①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
③8%蔗糖溶液。
④甲苯。
⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。
再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。
葡萄糖（毫克）=a×4式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数二、土壤淀粉酶3，5- 二硝基水杨酸比色法:1、试剂配制①1%淀粉。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法
2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。
它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。
土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。
2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。
2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。
2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。
根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。
表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。
表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。
土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4049
土壤酸性磷酸酶（S-ACP）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：UPLC-MS-4049规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
微量法试剂名称规格保存条件试剂一液体42mL×1瓶2-8℃保存试剂二粉剂×1瓶2-8℃保存试剂三液体5mL×1瓶2-8℃保存试剂四粉剂×2支2-8℃保存标准品液体1mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：用前加100mL蒸馏水充分溶解，2-8℃保存8周；2、试剂四：临用前取1瓶加576μL无水乙醇（自备），24μL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂可以2-8℃保存2周（变褐色后不能再使用，一瓶即可以实验100T，为延长反应时间故多给一瓶）；3、标准品：0.5μmol/mL苯酚标准液。
产品说明：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。
酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。
Phenyl Disodium Phosphate S-A CP,H+Phenol+Na2HPO4Phenol+2,6-Dibromobenzoquinone Chlorimide Alkaline Conditions Indoxyl(660nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、研钵、可调式移液器、30-50目筛、冰、蒸馏水、乙醇和甲苯（不允许快递）。
2.1土壤酸性磷酸酶活性测定
土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）pH5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L 醋酸钠溶液（16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL）14.8ml A + 35.2ml B混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm 处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
土壤酸性磷酸酶(soil acid phosphatase)活性测定试剂盒(分光光度法)使用说明
土壤酸性磷酸酶（soil acid phosphatase）活性测定试剂盒（分光光度法）使用说明货号:BC0140规格:50T/48S产品简介：土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响，根据最适pH范围，通常分为酸性、中性和碱性三种类型。
酸性环境中，S-ACP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-ACP活性。
产品内容：试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
用前加50mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体×1瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存。
临用前加1152μL无水乙醇（自备），48μL蒸馏水充分溶解。
（变褐色后不能再使用）标准品：液体×1支，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。
操作步骤：一、粗酶液提取：称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05mL甲苯（自备），轻摇15min；加0.4mL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。
8000rpm，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL蒸馏水，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A空白管。
3.标准管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL标准液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A标准管。
4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50μL上清液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm 测定吸光度，记为A测定管。
读《土壤酶及其研究法》
读《土壤酶及其研究法》书名：土壤酶及其研究法主编：关松荫出版社：农业出版社出版时间：1986年7月著书背境：当时土壤酵学研究进展很快，它已经成为土壤生物化学和土壤生物学研究中的重要内容。
我国许多土壤学工作者很注意土壤酌的研究，希望了解一些关于土壤酶的基本性质、理论和应用以及酶活性测定方法等。
另一方面，当时土壤酶分析法主要是沿用一写般生化研究中习用的方法且不够规范化，一些学者对土壤酶的认识也很不相同。
作为一个分支学科来说，不仅要在广度和深度方面加强其理论与实践研究，同时要逐渐完善它的试验方法。
本书就是根据这两方面的需要编写而成的。
绪论一、研究土壤酶的意义二、研究土壤酶的目的与任务三、土壤酶的研究内容四、土镶配学研究中的存在问题第一章土壤酶学研究简史第三章土壤酶的基本特性第三章土壤酶的状态与分布第四章土境酶在碳、氮、磷、硫生物循环中的作用第五章土壤酶与土壤代谢第六章土壤状况与土壤酶活性第七章土壤印活链与植物生长第八章农业技术对土壤酶的影响第九章土壤酶研究的应用第十章我国主要土壤的酶活性状况第十一章土壤酶研究的数理统计分析第十二章土壤酶活性测定以下是对书中个别章节的总结过氧化氢酶几乎存在在所有的生物体里，在某些细菌里，其数量为细胞干重的1%。
它能促进过氧化氢对各种化合物的氧化。
土壤的过氧化氢酶活性，与土壤呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映了土壤微生物学过程的强度。
根际土壤的过氧化氢酶活性，远较根际外土壤的为高。
有机质含量高的土壤，过氧化氢酶的活性较强。
因此，土壤过氧化氢酶的活性可以表征土壤总的生物学和肥力状况。
多酚氧化酶能酶促一.二.及三元酚的氧化。
氧化的最终产物是醌，如邻苯二酚在多酚氧化酶作用下可氧化成相应的醌。
Kohohoba M.M.（1965）指出：土壤中芳香族有机化合物转化为腐殖质组分的过程中，氧化酶特别是多酚氧化酶起着重要作用。
近年来的研究表明，某些微生物形成暗色腐殖物质的能力，取决于它们是否含有酚型氧化酶；泥炭土的多酚氧化酶活性显著地高于矿质土壤。
磷酸酶
AP在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上,测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾 病重要手段。AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查,患这些疾病时,肝细 胞过度制造AP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清AP明显升高。而 血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病,也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血 中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP,此种A P同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也 逐渐为人们所认识,如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLA P。骨型AP作为 骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视;血清骨型A P活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数,在其 他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病 人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改变,对骨型AP活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的 监测、病情预后等提供有效的依据。
在动物饲养和疾病诊断方面, AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供 应不足对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。年幼动物血液AP 主要来自骨骼,随着动物长大成熟和骨骼成年化,来自骨骼的AP逐渐减少。在动物营养研究中,血清AP活性常作为 重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷水平的适宜程度。在动物疾病诊断上,依据骨质疏松等骨骼疾病发生时 AP活性的变化规律,可应用血清AP活性来诊断因钙、磷及VD失调所引起的骨质疾病。
碱性
发现
应用
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, EC 3.1.3.1,AP)是非特异性磷酸单酯酶,可以催化几乎所有的磷酸单 酯的水解反应,生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等,还可以催化磷酸基团的转移反应,且大肠杆菌A P还是一种依 赖亚磷酸盐的氢化酶。AP存在于除高等植物外几乎所有的生物体内,可直接参加磷代谢,在钙、磷的消化、吸收、 分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。1911年Levene等、1912年Grosser等分离到(碱性)磷酸酯酶;1934年, Davis提出了碱性磷酸酶这一命名;1958年,Ag ren等用同位素标记的方法分离到磷酸丝氨酸;1961年, Schwartz 在大肠杆菌中也发现了这一复合物,并认为丝氨酸可能是AP活性部位的组成成分;1962年, Plocke等证实AP是一 种金属酶;1981年, Bradshaw测定了大肠杆菌AP氨基酸全序列,并克隆了大肠杆菌AP的基因phoA ;之后多种生物 AP的基因相继被克隆,近些年对AP的结构、作用机制和功能的研究越发深入,使AP的应用更加广泛 。
土壤中磷酸酶的测定
土壤中磷酸酶的测定1.引言1.1 概述磷酸酶是一类广泛存在于生物体内的酶，其在土壤中的存在和活性对于土壤生态系统的健康和可持续发展具有重要意义。
磷酸酶能够催化磷酸盐的水解反应，将无机磷转化为有机磷，使其能够被植物吸收利用。
因此，磷酸酶在土壤中起着极为关键的作用，对于磷的循环和土壤中磷的有效性具有重要影响。
土壤中的磷酸酶含量和活性可以作为评估土壤肥力和污染程度的重要指标之一。
磷酸酶的活性与土壤微生物的种类和数量密切相关，因此，通过检测土壤中磷酸酶的含量和活性，可以了解土壤的微生物群落结构和功能。
同时，磷酸酶检测还可以为土壤养分管理和农业生产提供重要参考依据。
本文将详细介绍磷酸酶的作用、检测方法以及磷酸酶检测的意义和应用前景。
通过深入了解磷酸酶在土壤中的作用和检测方法，我们可以更好地认识土壤生态系统的功能和特性，为土壤健康管理和农业可持续发展提供科学依据。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照如下结构展开对土壤中磷酸酶的测定进行探讨：1. 磷酸酶的作用：首先，我们将介绍磷酸酶在土壤中的重要作用以及其在植物生长和磷循环中的关键性。
通过深入了解磷酸酶的作用机制，我们能够更好地理解为什么需要对其进行测定。
2. 磷酸酶的检测方法：接下来，我们将介绍不同的磷酸酶测定方法，包括传统的色谱法、酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光法和分子生物学技术等。
我们将详细讨论每种方法的原理、优缺点及适用范围，并给出相应的实验步骤和操作注意事项。
3. 磷酸酶检测的意义：在此部分，我们将对磷酸酶检测的意义进行深入分析和讨论。
我们将提出磷酸酶检测在土壤质量评估、环境保护、农业生产和肥料管理等方面的重要性，并探讨其对土壤健康和可持续农业发展的影响。
4. 磷酸酶检测的应用前景：最后，我们将展望磷酸酶检测在未来的应用前景。
我们将探讨其在农业领域、环境科学和生物技术等方面的潜在应用，并对新技术和方法的发展方向进行展望。
通过以上的文章结构，我们将全面而系统地介绍土壤中磷酸酶的测定方法和应用价值，旨在提供对土壤质量和农业可持续发展有益的参考和指导。
磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响
㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(２):１１１~１１７ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０２.０１５收稿日期:２０２３－０４－１２基金项目:湖南省自然科学基金项目(２０２２ＪＪ５０２２５)ꎻ湖南省教育厅科学研究项目(２０ｂ５２９ꎬ２０Ａ４５１)ꎻ国家大学生创新创业项目(２０２２１０５４７０２３)作者简介:黎颖惠(１９８７ )ꎬ女ꎬ硕士ꎬ讲师ꎬ主要研究方向为微生物生态学ꎮＥ－ｍａｉｌ:２０４３４８８９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:杨贤均(１９７４ )ꎬ男ꎬ硕士ꎬ教授ꎬ主要研究方向为农业生态学ꎮＥ－ｍａｉｌ:２９７８５０７４＠ｑｑ.ｃｏｍ磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响黎颖惠ꎬ邢肖毅ꎬ仇旭ꎬ许仕荣ꎬ倪绯ꎬ赵炼ꎬ杨贤均(邵阳学院农林生态学院ꎬ湖南邵阳㊀４２００００)㊀㊀摘要:为明确施用磷肥对土壤磷活化的影响及微生物驱动机制ꎬ以为红壤区磷肥管理和高效利用提供理论依据ꎬ本试验以红壤区稻田土为供试材料ꎬ采用室内培养法ꎬ施入磷酸二氢钾ꎬ设置磷素水平分别为２０(Ｐ２０)㊁５０(Ｐ５０)㊁８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０)ꎬ２５ħ下培养一周ꎬ研究不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性及解磷菌分布的影响ꎮ结果表明ꎬ土壤磷有效性指数(土壤有效磷增加量占施磷量的百分比)随施磷量的增加而升高ꎮ磷素施用量为２０㊁５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷含量分别提升４.５３㊁１２.６５㊁２５.６９ｍｇ/ｋｇꎬ土壤磷有效性指数分别为２２.６５％㊁２５.３０％和３２.１１％ꎮ土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶和碱性磷酸酶ꎬ且酸性磷酸酶对磷肥的响应更强烈ꎬＰ５０处理土壤磷酸酶活性最高ꎬ其次是Ｐ２０处理ꎬＰ８０处理最低ꎮｐｈｏＤ高通量测序结果表明ꎬ施用磷肥显著降低土壤中含ｐｈｏＤ基因解磷菌的α多样性ꎬ影响解磷菌的群落组成ꎬＰ５０处理的ＯＴＵ７６９(未知类群)相对丰度高达约３０％ꎬ可能促进了磷酸酶活性及有效磷含量的增加ꎮＰ８０处理的ＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５(假单胞杆菌)总相对丰度约５０％ꎬ二者可能更多通过分泌有机酸溶解无机磷以增加有效磷含量ꎮ较高的磷肥施用量提高了有效磷供给效率ꎬ磷酸酶活性的增加可能是中等磷肥用量处理下有效磷增加的重要原因之一ꎬ而高磷肥用量处理下假单胞杆菌对无机磷的溶解可能起更重要的作用ꎮ关键词:磷肥ꎻ磷活化ꎻ稻田土壤ꎻ有效磷ꎻ磷酸酶ꎻｐｈｏＤꎻ解磷菌中图分类号:Ｓ１５４.２㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０２－０１１１－０７ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＲａｔｅｏｎＰｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅＳｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｉｎＰａｄｄｙＳｏｉｌＬｉＹｉｎｇｈｕｉꎬＸｉｎｇＸｉａｏｙｉꎬＱｉｕＸｕꎬＸｕＳｈｉｒｏｎｇꎬＮｉＦｅｉꎬＺｈａｏＬｉａｎꎬＹａｎｇＸｉａｎｊｕｎ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＦｏｒｅｓｔｒｙＥｃｏｌｏｇｙꎬＳｈａｏｙａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｙａｎｇ４２００００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｉｓｐａｐｅｒａｉｍｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ(Ｐ)ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｏｎｓｏｉｌＰａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｏ￣ｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｒｉｖｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇꎬａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒＰｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｍａｎ￣ａｇｅｍｅｎｔａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｕｓｅ.ＲｅｄｐａｄｄｙｓｏｉｌｗａｓｕｓｅｄａｓｍａｔｅｒｉａｌꎬａｎｄＰｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ(ＫＨ２ＰＯ４)ｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄａｔｒａｔｅｓｏｆ２０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ２０)ꎬ５０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ５０)ａｎｄ８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０).Ｔｈｅｓｏｉｌｗａｓｉｎｃｕｂａｔｅｄａｔ２５ħｆｏｒａｗｅｅｋｂｙｉｎｄｏｏｒｃｕｌｔｕｒｅꎬａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｓｏｉｌａｖａｉｌａｂｌｅＰ(ＡＰ)ｃｏｎｔｅｎｔꎬｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ(ＰＳＢ)ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｉｎｄｅｘ(ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＡＰｉｎｃｒｅｍｅｎｔｔｏｔｏｔａｌＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅ)ｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ.ＡＰｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄｂｙ４.５３ꎬ１２.６５ａｎｄ２５.６９ｍｇ/ｋｇｕｎｄｅｒＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆ２０ꎬ５０ꎬａｎｄ８０ｍｇ/ｋｇꎬｗｉｔｈＰｅｆｆｅｃ￣ｔｉｖｅｎｅｓｓｉｎｄｅｘｅｓｗａｓ２２.６６％ꎬ２５.３０％ａｎｄ３２.１１％ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｏｉｌａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ(ＡＣＰ)ｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｅｕｔｒａｌａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅꎬｗｈｉｃｈｗａｓｍｏｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎻｔｈｅａｃ￣ｔｉｖｉｔｙａｔｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ５０ｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＰ２０ａｎｄＰ８０ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ.ＡｌｐｈａｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｐｈｏＤ￣ｃｏｎｔａｉ￣ｎｉｎｇＰＳＢｉｎｓｏｉｌｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓａｆｆｅｃｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＯＴＵ７６９(ｕｎｋｎｏｗｎｔａｘａ)ｗａｓａｂｏｕｔ３０％ｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ５０ꎬｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｖａｉｌａｂｌｅＰｃｏｎｔｅｎｔ.ＴｈｅｔｏｔａｌｒｅｌａｔｉｖｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆＯＴＵ１０３６ａｎｄＯＴＵ９７５(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)ｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔＰ８０ｗａｓｕｐｔｏ５０％ꎬｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｉｎｃｒｅａｓｅｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｎｏｒｇａｎｉｃＰｂｙｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎ.ＴｏｓｕｍｕｐꎬｔｈｅｈｉｇｈｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｉｍｐｒｏｖｅｄｓｕｐｐｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＡＰꎬａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｍｉｇｈｔｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅａ￣ｓｏｎｓｆｏｒＡＰｉｎｃｒｅａｓｅｕｎｄｅｒｍｅｄｉｕｍＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｗｈｅｒｅａｓｉｎｏｒｇａｎｉｃＰｄｉｓｓｏｌｖｅｄｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｈｏｕｌｄｐｌａｙｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｉｍｐｒｏｖｉｎｇＡＰｃｏｎｔｅｎｔｕｎｄｅｒｈｉｇｈＰａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒꎻＰｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎꎻＰａｄｄｙｓｏｉｌꎻＡｖａｉｌａｂｌｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓꎻＰｈｏｓｐｈａ￣ｔａｓｅꎻｐｈｏＤꎻＰｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ㊀㊀磷素是植物生长必需的大量元素之一[１]ꎬ我国农田土壤普遍缺磷ꎮ一般认为ꎬ有效磷含量低于１０ｍｇ/ｋｇ的土壤即为缺磷土壤ꎮ而我国湖南㊁江西㊁广西㊁云南等典型红壤区ꎬ土壤有效磷含量多在５ｍｇ/ｋｇ左右ꎬ远低于世界平均水平ꎮ施用磷肥是提高土壤有效磷含量的重要途径ꎬ红壤区磷肥投入水平往往较高[２]ꎮ然而ꎬ红壤富含铁铝矿物ꎬ对磷素具有极强的结合固定能力ꎬ研究显示约有８０％的磷肥进入红壤后ꎬ通过吸附㊁共沉淀等过程被土壤颗粒快速固定ꎬ成为难以被作物吸收利用的固定形态[３]ꎬ导致土壤中固定态磷大量蓄积[４]ꎮ因此ꎬ红壤中存在着有效磷不足与固定态磷盈余的双重问题ꎮ活化土壤磷库ꎬ开发和有效利用被土壤固定的磷ꎬ提高土壤磷素利用效率ꎬ是解决上述矛盾的关键ꎮ有研究表明ꎬ适量施用磷肥不仅可以补充外源速效磷ꎬ还可降低土壤对磷酸根的吸附量[５]ꎬ甚至促进土壤本底磷的矿化[６－７]ꎬ提高土壤供磷能力[８]ꎮＢａｕｋｅ等[９]对磷肥施用条件下土壤本底磷释放能力的研究结果表明ꎬ相较于不施磷肥ꎬ适量施用磷肥更有利于底层土壤固定态磷的释放ꎮ土壤中分布着大量的解磷菌ꎬ是土壤磷活化的主要驱动者[１０－１２]ꎬ可通过分泌磷酸酶促进有机磷的活化[１３]ꎮ解磷菌在自然状态下ꎬ多处于休眠或潜在活跃状态ꎬ解磷效率较低[１４]ꎮ适当施用磷肥可刺激解磷菌的生长ꎬ激发土壤本底无效磷的释放[７ꎬ１３ꎬ１５－１６]ꎮ李春越等[７]基于分离培养法研究发现ꎬ适当施用磷肥[６０ｋｇ/(ｈｍ２ ａ)]可提高黄土区农田土壤有机磷和无机磷细菌丰度ꎬ且有机磷细菌对磷肥更为敏感ꎬ最终促进有机磷矿化ꎮ微生物对有机磷的活化主要指磷酸酶的矿化作用ꎬ其中碱性磷酸酶几乎特异性地来源于微生物[１３ꎬ１７]ꎬ因此被认为是有机磷微生物活化过程的重要驱动者ꎮ碱性磷酸酶的编码基因ｐｈｏＤ由于分布广泛ꎬ活性强㊁多样性高ꎬ被广泛应用于土壤有机磷转化过程的研究ꎮ已有研究表明ꎬ当土壤适量施用化学磷肥时ꎬ可提高含ｐｈｏＤ基因的解磷菌丰度及某些特定类群的相对丰度ꎬ继而增加磷酸酶活性ꎬ提高土壤有效磷含量[１３ꎬ１７－１８]ꎮ例如ꎬ当土壤中施入５０ｍｇ/ｋｇ的磷素时ꎬ相较于不施磷肥和２００ｍｇ/ｋｇ的施磷处理ꎬ其ｐｈｏＤ基因丰度最高ꎬ且不同用量磷肥施用条件下ꎬ解磷菌的组成不同[１８]ꎮ然而ꎬ当化学磷肥施用量较大时ꎬ会抑制解磷菌的生长和磷酸酶的合成[１３ꎬ１８]ꎮ尽管目前关于磷活化的研究已经较多ꎬ但是对于红壤区磷肥施用量对土壤磷活化及解磷菌群落结构影响的研究还比较少见ꎬ解磷菌在磷活化中的作用尚不明确ꎮ为此ꎬ本研究以红壤区稻田土壤为材料ꎬ对比分析磷肥不同施用量处理下ꎬ土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性的变化ꎬ以及含ｐｈｏＤ基因解磷菌的群落特征ꎬ明确磷肥施用对土壤磷活化的影响及其微生物驱动机制ꎬ以期为红壤区磷肥高效利用提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试土壤和培养方法２０２０年１０月在湖南省邵阳市红壤区采集稻田０~２０ｃｍ土层土壤ꎬ土壤有效磷含量为１１.３９２１１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｍｇ/ｋｇꎮ土样风干过２ｍｍ筛后ꎬ调节土壤水分为２５％孔隙充水度(２５％ＷＦＰＳ)ꎬ２５ħ培养一周以恢复微生物活性ꎮ以磷酸二氢钾形式施入磷肥ꎬ磷素设置２０(Ｐ２０)㊁５０(Ｐ５０)㊁８０ｍｇ/ｋｇ(Ｐ８０)３个水平ꎬ调节土壤水分为６０％田间持水量ꎬ每个处理称取５０ｇ土壤ꎬ于１００ｍＬ玻璃培养钵中进行好氧培养ꎬ每处理重复３次ꎬ在２５ħ下培养一周ꎮ１.２㊀样品采集、测定项目及方法培养结束后ꎬ充分混匀培养钵中的土壤样品ꎬ取约１０ｇ样品置于－８０ħ条件下保存ꎬ用于测定含ｐｈｏＤ基因解磷菌群落结构ꎬ其余样品于４ħ保存ꎬ用于测定土壤有效磷含量和磷酸酶活性ꎮ土壤总ＤＮＡ的提取采用ｍｏｂｉｏ试剂盒ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌的扩增引物为ＡＬＰＳ－７３０Ｆ(ＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＴ)和ＡＬＰＳ－１１０１Ｒ(ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＣＧ)[６]ꎮ扩增条件为９５ħ５ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ５８ħ３０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２ħ１０ｍｉｎꎮ高通量测序平台为Ｉｌｌｕｍｉ￣ｎａꎬ由上海美吉生物医药科技有限公司完成ꎬ测序数据按９７％序列相似度划分ＯＴＵꎮ土壤有效磷含量采用钼蓝比色法测定ꎬ土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法ꎬ酸性㊁中性㊁碱性磷酸酶的缓冲液分别为醋酸㊁柠檬酸和硼酸缓冲液ꎮ１.３㊀数据处理与分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１７整理数据ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０软件进行统计分析ꎮα多样性指数中ꎬＡｃｅ和Ｃｈａｏ１指数用来估计样本中ＯＴＵ数目ꎬＳｉｍｐ￣ｓｏｎ和Ｓｈａｎｎｏｎ指数用来估计样本中微生物的多样性ꎮ土壤有效磷含量㊁磷酸酶活性以及含ｐｈｏＤ解磷菌α多样性的比较采用单因素方差分析(Ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ)ꎬＤｕｎｃａｎ ｓ法进行差异显著性检验(Ｐ<０.０５)ꎮ采用主成分分析法(ＰＣＡ)分析土壤解磷菌群落结构ꎬ数据可视化采用Ｃａｎｏｃｏ４.５软件进行ꎮ将ＯＴＵ代表序列运用ＢＬＡＳＴ进行序列对比(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)ꎬ明确分类信息ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量的影响磷肥施用量显著影响土壤有效磷含量(图１)ꎮ供试土壤原始有效磷含量为１１.３９ｍｇ/ｋｇꎬ施加２０㊁５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ磷素后ꎬ土壤有效磷含量分别升至１５.９２㊁２４.０４㊁３７.０８ｍｇ/ｋｇꎬ仅分别增加４.５３㊁１２.６５㊁２５.６９ｍｇ/ｋｇꎮ可见施入土壤中的磷肥被大量固定ꎬ只有小部分转化为有效磷ꎮ三种施肥量条件下ꎬ土壤磷有效性指数(土壤有效磷增加量占施磷量的百分比)分别为２２.６５％㊁２５.３０％和３２.１１％ꎬ表明随着磷肥施用量的增加ꎬ有更高比例的磷素转化为土壤有效磷ꎮ柱上不同小㊁大写字母分别表示土壤有效磷增量及土壤磷有效性指数不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图１㊀不同磷肥用量对稻田土壤有效磷含量的影响２.２㊀不同磷肥用量对稻田土壤磷酸酶活性的影响由图２可见ꎬ整体而言ꎬ土壤酸性磷酸酶活性高于中性磷酸酶ꎬ碱性磷酸酶活性最低ꎬ表明土壤酸性磷酸酶对磷肥的响应更为强烈ꎮ随磷肥施用量的增加ꎬ土壤酸性磷酸酶活性呈先增加后降低趋势ꎬＰ５０处理条件下活性最高ꎬ达４.０６ｍｇ ｇ－１ ｄ－１ꎬ显著高于Ｐ２０和Ｐ８０处理ꎬ而后二者间无显著差异ꎮ中性磷酸酶和碱性磷酸酶活性也表现为Ｐ５０处理最高ꎬ但３个施肥处理间差异较小ꎬ均未达显著水平ꎮ柱上不同小写字母代表不同施肥量处理下同类型磷酸酶活性在０.０５水平上差异显著ꎮ图２㊀不同磷肥用量条件下土壤磷酸酶活性２.３㊀不同磷肥用量对稻田土壤解磷菌α多样性的影响土壤中含ｐｈｏＤ基因解磷菌的Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１和３１１㊀第２期㊀㊀㊀㊀黎颖惠ꎬ等:磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响Ｓｈａｎｎｏｎ指数均随磷肥施用量的增加而显著降低ꎬ而Ｓｉｍｐｓｏｎ则呈现相反趋势(表１)ꎮ与Ｐ２０处理相比ꎬＰ５０㊁Ｐ８０处理下解磷菌Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数分别降低１４.９％㊁３０.３％㊁１５.０％㊁２７.７％和１３.１％㊁２５.０％ꎮＳｉｍｐｓｏｎ指数则以Ｐ２０处理最低ꎬ与Ｐ５０和Ｐ８０处理差异达显著水平ꎬ但后两者无显著差异ꎮ综上可知ꎬ施用磷肥导致土壤解磷菌的丰富度和多样性显著降低ꎬ且施肥量越大ꎬ降幅越大ꎮ㊀㊀表１㊀不同磷肥用量处理下土壤中含ｐｈｏＤ解磷菌的α多样性指数磷素用量/(ｍｇ/ｋｇ)ＡｃｅＣｈａｏ１ＳｈａｎｎｏｎＳｉｍｐｓｏｎ２０７７２ʃ２８ａ７７３ʃ２９ａ４.１２ʃ０.１２ａ０.０４ʃ０.００１ｂ５０６５７ʃ３０ｂ６５７ʃ３２ｂ３.５８ʃ０.２２ｂ０.１１ʃ０.００１ａ８０５３８ʃ２６ｃ５５９ʃ２７ｃ３.０９ʃ０.１５ｃ０.１２ʃ０.００２ａ㊀㊀注:同列数据后不同小写字母表示不同处理下α多样性指数在０.０５水平上差异显著ꎮ２.４㊀不同磷肥用量对稻田土壤解磷菌群落组成的影响对含ｐｈｏＤ基因解磷菌的群落结构进行ＰＣｏＡ分析(图３)ꎬ前两轴对总变异的累积贡献率为７８.２％ꎮ相同磷用量处理的土壤样品在ＰＣｏＡ图上相对聚集ꎬ而不同用量处理的样品则明显分开ꎬ表明施用磷肥强烈影响含ｐｈｏＤ解磷菌的群落结构ꎮ图３㊀不同磷肥用量条件下土壤解磷菌群落ＰＣｏＡ图对相对丰度大于５％的ＯＴＵ绘制解磷菌群落组成图(图４)ꎬ可以看出三种施肥量条件下土壤解磷菌组成差异明显ꎮ总体而言ꎬＯＴＵ７６９相对丰度最大ꎬＰ５０处理下达到近３０％ꎬ其次分别是Ｐ８０和Ｐ２０处理ꎬ相对丰度分别为２０.０９％和９.７６％ꎮ将其代表序列在ＮＣＢＩ数据库进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ未比对上已有序列ꎮＯＴＵ１０３６同样具有较高的丰度ꎬ尤其是Ｐ８０处理相对丰度为２４.９３％ꎬ而Ｐ２０和Ｐ５０处理相对丰度均在１０％左右ꎮ另外ＯＴＵ９７５也对施肥表现出明显响应ꎬ且其相对丰度同样以Ｐ８０处理最高ꎬ为１１.７４％ꎬ而其他两个处理下相对丰度均在５％左右ꎮ根据序列比对ꎬＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５可能从属于假单胞杆菌属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)ꎮ图４㊀不同磷肥用量条件下土壤解磷菌群落组成图３㊀讨论本试验结果表明ꎬ施用外源磷肥显著提高土壤有效磷含量ꎬ且随磷肥用量的增加ꎬ土壤有效磷含量升高ꎬ但土壤有效磷的增加量远低于外源补充的磷量ꎮ由此可见ꎬ大量的外源磷肥被土壤颗粒所固定ꎮ这是因为红壤富含铁铝矿物ꎬ对磷素具有极强的结合固定能力ꎮ本研究中ꎬ当磷素施用量为２０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷仅增加４.５３ｍｇ/ｋｇꎬ约为施用量的２２％ꎮ而当施磷量增加至５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ土壤有效磷增加量占施用量的比重有所提高ꎬ分别为２５.３０％㊁３２.１１％ꎮ即随磷肥施用量的增加ꎬ有更高比例的磷素转化为有效磷ꎮ向晓玲等[１９]研究也发现ꎬ易解吸磷随施磷量的增加而增加ꎮ另外ꎬ较高的磷肥用量也可能促进了土壤磷的活化ꎮ马殿叶[２０]研究发现ꎬ磷素活化系数随磷肥施用量的增加而升高ꎮ解磷微生物分泌磷酸酶对有机磷进行矿化[６ꎬ１８]是磷活化的重要途径之一ꎮ本研究发现ꎬ土壤酸性㊁中性㊁碱性磷酸酶活性均表现为Ｐ５０处理最高ꎬ其次为Ｐ２０和Ｐ８０处理ꎬ并且以酸性磷酸酶最为敏感ꎮ已有研究证明酸性磷酸酶在红壤中具有较高的活性[２１－２２]ꎮ另外ꎬ酸性磷酸酶活４１１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀性易受土壤有效磷含量的影响[２３－２４]ꎮ当土壤本底磷含量较低时ꎬ适当的磷素投入会刺激磷酸酶的表达以满足微生物的需求[５ꎬ２５]ꎬ而过高的投入由于缓解了微生物的磷饥饿ꎬ磷酸酶的分泌减少[１６ꎬ２４]ꎮ马殿叶[２０]研究表明ꎬ当磷肥施用量为５０ｋｇ/ｈｍ２时ꎬ磷酸酶活性高于０㊁２５㊁１００㊁２００ｋｇ/ｈｍ２和４００ｋｇ/ｈｍ２处理ꎮ磷酸酶活性的增加可能会导致有机磷的矿化ꎬ从而提高土壤有效磷含量ꎬ有研究表明土壤磷酸酶活性与有效磷含量呈显著正相关[２６－２７]ꎮ然而ꎬ本研究中ꎬ磷酸酶活性以Ｐ５０处理最高ꎬ而磷的有效性指数以Ｐ８０处理最高ꎬ磷酸酶活性与有效磷的增量并未表现出显著的相关性ꎬ由此可见ꎬ磷酸酶活性的改变并不是磷有效性指数变化的主要因素ꎮ施用磷肥之所以提高土壤磷有效性指数ꎬ可能是因为较高磷肥用量降低了土壤的磷素吸附能力ꎮ有研究发现ꎬ随磷肥施用量的增加ꎬ土壤中高能吸附点位逐渐饱和ꎬ磷的吸附转为低能吸附ꎬ因而土壤吸附量降低ꎬ而解吸量增加[２８－２９]ꎮ另外ꎬ本研究施用的磷肥为磷酸二氢钾ꎬ可导致土壤ｐＨ值的降低ꎬ从而促进无机磷的溶解ꎬ最终影响土壤有效磷含量ꎮ综上所述ꎬ本研究发现ꎬ施用适量磷素(５０ｍｇ/ｋｇ)增加了土壤磷酸酶活性ꎬ可能促成了该处理下土壤磷有效性指数的增加ꎬ而高磷施用量处理下(８０ｍｇ/ｋｇ)ꎬ除外源施用的磷素外ꎬ磷吸附量的降低和无机磷溶解量的增加也可能促进了有效磷含量的增加ꎮ磷肥不同施用量处理下ꎬ磷酸酶活性的改变依赖于土壤解磷微生物对施肥的响应ꎮ就多样性而言ꎬ随着磷肥施用量的增加ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌的Ａｃｅ㊁Ｃｈａｏ１和Ｓｈａｎｎｏｎ指数显著降低ꎬ而Ｓｉｍｐｓｏｎ则有所增加ꎬ表明磷肥施用导致土壤解磷菌的物种丰富度和多样性降低ꎮ施肥对土壤微生物多样性的影响已有很多研究ꎮ一般认为ꎬ适量施肥ꎬ尤其是无机肥和有机肥配合施用ꎬ可为土壤微生物提供较多的能源和较全面的养分[３０]ꎬ促进多种类群微生物的大量繁殖ꎬ从而提高土壤微生物的多样性[３１]ꎮ而施肥不均衡则可能对微生物群落的多样性产生负效应[３２]ꎮ本研究仅施用了磷酸二氢钾ꎬ未提供碳氮元素ꎬ无法为微生物提供均衡的营养和能源ꎬ可能会导致对磷钾素竞争力高的微生物类群大量繁殖ꎬ争夺大量的能源和营养ꎬ而其他微生物相对减少ꎬ从而降低物种丰富度和多样性ꎮ本研究中Ｐ５０和Ｐ８０处理下ꎬＯＴＵ１０３６和ＯＴＵ９７５的相对丰度显著增加ꎬ根据序列比对ꎬ二者可能从属于假单胞杆菌ꎮ而以往的研究发现假单胞杆菌对磷素具有较强的竞争力[３３]ꎮ一般认为ꎬ微生物多样性的降低会严重损伤生态系统功能[１８ꎬ３４]ꎮ本研究中ꎬ当磷素施用量为５０㊁８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ有效磷的相对增量更大ꎮ这可能是因为当多样性降低导致生态系统功能受损时ꎬ微生物通过增加数量㊁改变组成或互作关系等进行功能补偿[３５－３７]ꎮ磷肥不同施用量处理下ꎬ土壤解磷菌群落结构差异显著ꎮＰ５０处理下ꎬＯＴＵ７６９的相对丰度大幅增加ꎬ达到近３０％ꎬ此时磷酸酶活性也最大ꎬ因此推测该类群可能是分泌磷酸酶的主要类群ꎬ但是并未在ＮＣＢＩ数据库中比对到相似序列ꎮＰ８０处理下ꎬＯＴＵ１３０６和ＯＴＵ９７５相对丰度显著增加ꎬ达３６.７％ꎬ根据序列比对ꎬ二者可能从属于假单胞菌ꎮ假单胞菌是红壤中常见的一种强解磷细菌[３８－３９]ꎬ且对磷肥施用敏感[１８]ꎬ其解磷机制主要是通过分泌有机酸溶解固定态无机磷[４０]ꎮ由此推测ꎬ施用磷肥可能促进了土壤中磷的活化ꎬ但不同用量处理下ꎬ解磷菌释放有效磷的方式可能不同ꎬ磷素用量为５０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ解磷菌主要分泌磷酸酶矿化有机磷ꎬ而磷素用量为８０ｍｇ/ｋｇ时ꎬ解磷菌可能更多地通过分泌有机酸实现对无机磷的溶解ꎮ李春越等[７]的研究也证明ꎬ无机解磷菌更偏好高磷环境ꎬ而有机解磷菌更偏好相对较低的磷素环境ꎮ本研究采用差减法计算磷肥施用条件下有效磷活化量ꎬ具有一定的不准确性ꎬ未来将采用同位素标记准确定量磷活化量ꎮ另外ꎬ本试验仅研究了磷肥施用条件下解磷菌和磷酸酶活性的变化ꎬ尚不足以阐明磷活化机制ꎬ未来的研究中将进一步关注有机酸组分及其含量的变化ꎬ溶无机磷和解有机磷微生物的分布特征ꎬ并从ｍＲＮＡ的角度探索解磷菌的变化特征ꎬ以全面分析磷肥施用对土壤磷转化过程的影响ꎬ揭示土壤有效磷激发的机制ꎮ４㊀结论磷肥施用量影响土壤供磷效率ꎬ在２０~８０５１１㊀第２期㊀㊀㊀㊀黎颖惠ꎬ等:磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响ｍｇ/ｋｇ的磷素用量范围内ꎬ土壤磷有效性指数逐渐增加ꎮ施用磷肥降低了土壤解磷菌的多样性ꎬ同时改变了解磷菌的组成ꎮ磷肥不同用量条件下ꎬ有效磷增加的途径可能不同ꎬ５０ｍｇ/ｋｇ磷素用量条件下ꎬ土壤磷酸酶活性最高ꎬ同时ꎬ含ｐｈｏＤ基因解磷菌中ＯＴＵ７６９(种属信息未知)相对丰度最高ꎬ推测该物种可能具有分泌磷酸酶的能力ꎬ为促进土壤本底有机磷矿化的主要物种ꎻ８０ｍｇ/ｋｇ磷素处理下ꎬ土壤磷酸酶活性较低ꎬ而假单胞属的相对丰度大幅增加ꎬ推测假单胞菌可能是通过分泌有机酸溶解无机磷ꎬ从而增加有效磷含量ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀高文龙ꎬ张赢心ꎬ卢英进ꎬ等.不同磷素用量对玉米生长及生理生化指标的影响[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(４):９０－９４.[２]㊀ＬｉｕＭꎬＬｉｕＪꎬＣｈｅｎＸＦꎬｅｔａｌ.Ｓｈｉｆｔｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎａｐａｄｄｙｓｏｉｌｆａｃｅｄｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｕｒｐｌｕｓ[Ｊ].Ｂｉ￣ｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０１８ꎬ５４(２):２５９－２６７. [３]㊀ＺｈｕＪＭꎬＫａｅｐｐｌｅｒＳＭꎬＬｙｎｃｈＪＰ.ＭａｐｐｉｎｇｏｆＱＴＬｃｏｎｔｒｏｌ￣ｌｉｎｇｒｏｏｔｈａｉｒｌｅｎｇｔｈｉｎｍａｉｚｅ(ＺｅａｍａｙｓＬ.)ｕｎｄｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＳｏｉｌꎬ２００５ꎬ２７０(２):２９９－３１０. [４]㊀张峰.蚯蚓粪肥对水稻土磷形态转化以及固定态磷活化的影响[Ｄ].贵阳:贵州大学ꎬ２０１９.[５]㊀ＮｉｕＬＡꎬＨａｏＪＭꎬＺｈａｎｇＢＺꎬｅｔａｌ.Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒａｎｄｔｉｌｌａｇｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｎｓｏｉｌｆｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＰｌａｉｎ[Ｊ].Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅꎬ２０１１ꎬ２１(６):８１３－８２０. [６]㊀ＨｕＹＪꎬＸｉａＹＨꎬＳｕｎＱꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｆｅｒｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｎｐｈｏＤ￣ｈａｒｂｏｒｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎＫａｒｓｔｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅｏｆｔｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬ２０１８ꎬ６２８/６２９:５３－６３. [７]㊀李春越ꎬ薛英龙ꎬ王益ꎬ等.长期施肥对黄土旱塬农田土壤氮素生理菌群和解磷菌的影响[Ｊ].生态学杂志ꎬ２０２０ꎬ３９(１１):３６５８－３６６７.[８]㊀郭斗斗ꎬ黄绍敏ꎬ张珂珂ꎬ等.有机无机外源磷素长期协同使用对潮土磷素有效性的影响[Ｊ].植物营养与肥料学报ꎬ２０１８ꎬ２４(６):１６５１－１６５９.[９]㊀ＢａｕｋｅＳＬꎬｖｏｎＳｐｅｒｂｅｒＣꎬＴａｍｂｕｒｉｎｉＦꎬｅｔａｌ.Ｓｕｂｓｏｉｌｐｈｏｓ￣ｐｈｏｒｕｓｉｓａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｒｅｇｉｍｅｉｎｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ￣ａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｒｉａｌｓ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１８ꎬ６９(１):１０３－１１２.[１０]ＡｌｏｒｉＥＴꎬＧｌｉｃｋＢＲꎬＢａｂａｌｏｌａＯＯ.Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｏｌ￣ｕｂｉｌｉｚａｉｔｏｎａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｕｓｅｉｎｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:９７１.[１１]ＺａｆｆａｒＢꎬＺａｒｇａｒＭＹꎬＭｏｈｉｄｄｉｎＦＡꎬｅｔａｌ.Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｏｌｕ￣ｂｉｌｉｚｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｄｉｖｅｔｓｉｔｙ[Ｊ].Ｉｎｔｅｒｎａ￣ｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＳｔｕｄｉｅｓꎬ２０１７ꎬ５(５):６６６－６７３. [１２]吴昀纾ꎬ蔡柏岩.丛枝菌根真菌介导植物磷元素吸收机理的研究进展[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２２ꎬ５４(８):１３７－１４３. [１３]ＴａｎＨꎬＢａｒｒｅｔＭꎬＭｏｏｉｊＭＪꎬｅｔａｌ.Ｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｆｅｒ￣ｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｔｈｅｐｈｏＤｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｍｉｎｅｒａｌｉｓｅｒｇｒｏｕｐｉｎｐａｓｔｕｒｅｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０１３ꎬ４９:６６１－６７２. [１４]ＣｏｌｌａｖｉｎｏＭＭꎬＳａｎｓｂｅｒｒｏＰＡꎬＭｒｏｇｉｎｓｋｉＬＡꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒ￣ｉｓｏｎｏｆｉｎｖｉｔｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｖｅｒｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ￣ｓｏｌｕ￣ｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｎａｔｉｖｅｔｏａｃｉｄｓｏｉｌａｎｄｔｈｅｉｒａｂｉｌｉｔｙｔｏｐｒｏｍｏｔｅＰｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓｇｒｏｗｔｈ[Ｊ].ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０１０ꎬ４６(７):７２７－７３８.[１５]ＦｒａｓｅｒＴＤꎬＬｙｎｃｈＤＨꎬＢｅｎｔＥꎬｅｔａｌ.ＳｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈｏＤｇｅｎｅａｂｕｎｄａｎｃｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｐｐｌｉｅｄｐｈｏｓ￣ｐｈｏｒｕｓａｎｄｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｍａｎａｇｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１５ꎬ８８:１３７－１４７.[１６]朱丛飞ꎬ罗汉东ꎬ胡冬南ꎬ等.油茶林土壤生化性对磷素水平的响应研究[Ｊ].中南林业科技大学学报ꎬ２０１７ꎬ３７(２):５７－６２.[１７]ＷｅｉＸＭꎬＨｕＹＪꎬＲａｚａｖｉＢＳꎬｅｔａｌ.Ｒａｒｅｔａｘａｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒａｓｅ￣ｈａｒｂｏｒｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｍｅｄｉａｔｅｓｏｉｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１９ꎬ１３１:６２－７０.[１８]ＬｏｎｇＸＥꎬＹａｏＨＹꎬＨｕａｎｇＹꎬｅｔａｌ.Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｌｅｖｅｌｓｉｎｆｌｕ￣ｅｎｃｅｔｈｅｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｒｈｉｚｏｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｃａｒｂｏｎａｎｄｔｈｅｐｈｏｓ￣ｐｈａｔｅ￣ｓｏｌｕｂｉｌｉｓｉｎｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎａｐａｄｄｙｓｏｉｌ[Ｊ].ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１８ꎬ１１８:１０３－１１４.[１９]向晓玲ꎬ陈松鹤ꎬ杨洪坤ꎬ等.秸秆覆盖与施磷对四川丘陵旱地土壤磷形态及有效性的影响[Ｊ].应用生态学报ꎬ２０２２ꎬ３３(１２):３３－３７.[２０]马殿叶.不同供磷水平下紫色土磷素赋存及土壤微生物活化利用潜力分析[Ｄ].重庆:西南大学ꎬ２０２１.[２１]王晓萍ꎬ吴洵ꎬ俞永明.红壤茶园磷酸酶活性的研究[Ｊ].茶叶科学:英文ꎬ１９８９ꎬ９(２):９９－１０８.[２２]莫雪ꎬ陈斐杰ꎬ游冲ꎬ等.黄河三角洲不同植物群落土壤酶活性特征及影响因子分析[Ｊ].环境科学ꎬ２０２０ꎬ４１(２):８９５－９０４.[２３]沈菊培ꎬ陈振华ꎬ陈利军.草甸棕壤水稻田土壤磷酸酶活性及对施肥措施的响应[Ｊ].应用生态学报ꎬ２００５ꎬ１６(３):５８３－５８５.[２４]杨文娜ꎬ余泺ꎬ罗东海ꎬ等.土壤ｐｈｏＣ和ｐｈｏＤ微生物群落对化肥和有机肥配施生物炭的响应[Ｊ].环境科学ꎬ２０２２ꎬ４３(２):１０４０－１０４９.[２５]ＷｒｉｇｈｔＡＬꎬＲｅｄｄｙＫＲ.Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｌｏａｄｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎｅｘｔｒａ￣ｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＥｖｅｒｇｌａｄｅｓｗｅｔｌａｎｄｓｏｉｌｓ[Ｊ].ＳｏｉｌＳｃｉｅｎｃｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｍｅｒｉｃａＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ６５(２):５８８－５９５. [２６]李艳ꎬ吴强盛.菌根真菌对不同基因型柑橘根际有效磷含量和磷酸酶活性的影响[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１４ꎬ４２(６):１８６－１８８.[２７]战厚强ꎬ颜双双ꎬ王家睿ꎬ等.水稻秸秆还田对土壤磷酸酶活性及速效磷含量的影响[Ｊ].作物杂志ꎬ２０１５(２):７８－８３.６１１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[２８]ＺｈａｎｇＹＨꎬＨｕａｎｇＳＭꎬＧｕｏＤＤꎬｅｔａｌ.Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｄｓｏｒｐ￣ｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｘｔｕｒａｌｆｌｕｖｏ￣ａｑｕｉｃｓｏｉｌｓｕｎｄｅｒｌｏｎｇ￣ｔｅｒｍｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｉｌｓａｎｄＳｅｄｉｍｅｎｔｓꎬ２０１９ꎬ１９(３):１３０６－１３１８.[２９]王琼ꎬ陈延华ꎬ张乃于ꎬ等.长期施磷黑土中磷的吸附－解吸特征及其影响因素[Ｊ].植物营养与肥料学报ꎬ２０２２ꎬ２８(９):１５６９－１５８１.[３０]徐阳春ꎬ沈其荣ꎬ冉炜.长期免耕与施用有机肥对土壤微生物生物量碳㊁氮㊁磷的影响[Ｊ].土壤学报ꎬ２００２ꎬ３９(１):８９－９６.[３１]罗希茜ꎬ郝晓晖ꎬ陈涛ꎬ等.长期不同施肥对稻田土壤微生物群落功能多样性的影响[Ｊ].生态学报ꎬ２００９ꎬ２９(２):７４０－７４８.[３２]张瑞ꎬ张贵龙ꎬ陈冬青ꎬ等.不同施肥对农田土壤微生物功能多样性的影响[Ｊ].中国农学通报ꎬ２０１３ꎬ２９(２):１３３－１３９.[３３]杨柳燕ꎬ蒋丽娟ꎬ秦伯强ꎬ等.铜绿微囊藻与附生假单胞菌静态吸磷的比较[Ｊ].中国环境科学ꎬ２００４ꎬ２４(５):５７２－５７５.[３４]ＸｉｎｇＸＹꎬＸｕＨＦꎬＷａｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｎｉｔｒｏｇｅｎｕｓｅａｇｇｒａｖａｔｅｓｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｎｅｔｗｏｒｋｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｔｅｍｐｅｒａ￣ｔｕｒｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔꎬ２０２２ꎬ１２(１):１３９８９. [３５]ＭｃＧｒａｄｙ￣ＳｔｅｅｄＪꎬＭｏｒｉｎＰＴ.Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬｄｅｎｓｉｔｙｃｏｍｐｅｎｓａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｓ[Ｊ].Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ８１(２):３６１－３７３.[３６]ＪｉａｎｇＬ.Ｄｅｎｓｉｔｙｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎｃａｎｃａｕｓｅｎｏｅｆｆｅｃｔｏｆｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉ￣ｔｙｏｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｏｉｋｏｓꎬ２００７ꎬ１１６(２):３２４－３３４.[３７]ＦａｕｓｔＫꎬＲａｅｓＪ.Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ:ｆｒｏｍｎｅｔｗｏｒｋｓｔｏｍｏｄ￣ｅｌｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１０(８):５３８. [３８]ＫａｒｉｍｚａｄｅｈＪꎬＡｌｉｋｈａｎｉＨＡꎬＥｔｅｓａｍｉＨꎬｅｔａｌ.Ｉｍｐｒｏｖｅｄｐｈｏｓ￣ｐｈｏｒｕｓｕｐｔａｋｅｂｙｗｈｅａｔｐｌａｎｔ(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)ｗｉｔｈｒｈｉ￣ｚｏｓｐｈｅｒｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓｓｔｒａｉｎｓｕｎｄｅｒｗａｔｅｒ￣ｄｅｆｉｃｉｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬ２０２１ꎬ４０(１):１６２－１７８.[３９]王淑真ꎬ梁晶晶ꎬ包明琢ꎬ等.不同林龄杉木林土壤磷形态与解磷菌变化[Ｊ].林业科学ꎬ２０２２ꎬ５８(２):５８－６９. [４０]刘辉ꎬ吴小芹ꎬ叶建仁ꎬ等.荧光假单胞菌的溶磷机制及其在杨树菌根际的定殖动态[Ｊ].林业科学ꎬ２０２１ꎬ５７(３):９０－９７.７１１㊀第２期㊀㊀㊀㊀黎颖惠ꎬ等:磷肥用量对红壤区稻田土壤磷酸酶活性及解磷菌分布的影响。
土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的测定
土壤酶活性的测定方法及部分样品配制详细请参考《土壤微生物分析方法手册》，《土壤酶及其研究法》土壤样品采集与制备土壤样品取样后混匀，用于土壤酶活性测定的土壤磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测。
1.土壤酶活性的测定方法1.1.脲酶采用靛酚蓝比色法方法原理：本法基于以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，用于尿酶活性的测定。
操作步骤：取10g风干土，置于100ml三角瓶中，加2ml甲苯，15min后加10ml 10%尿素液和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养3h。
按此操作，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定，过滤后取0.5ml滤液于50ml比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。
绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
pH6.7柠檬酸盐缓冲液：用368g柠檬酸溶于600ml水，另取295g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液混合，然后用1M的氢氧化钠调节pH到6.7，定容到2L。
苯酚溶液：称取苯酚（C6H5OH）10g和硝基铁氰化钠[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。
此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
次氯酸钠碱性溶液：称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O, 化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4·12H2O, 化学纯）31.8g 和52.5g·L-1次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL 溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
标线绘制：取稀释的标准液0、l、2、4、6、8、10ml，移于50rnl容量瓶中，然后加入蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酸钠溶液和4mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶（酸性、中性和碱性磷酸酶1.土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2.Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
（用缓冲液配制）；取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、-1浓度的酚标准溶液梯度。
30min后比色测定。
绘制标准曲0.0018、0.0022和0.0026mg?g线。
5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37?下培养24h。
土壤磷酸酶活性及其影响因素研究
15 卷第 4 期
于群英 土壤磷酸酶活性及其影响因素研究
7
注: 盆栽时间为 30 天取的土样
一些研究表明, 有机肥料的施用可明显提高土 壤磷酸酶活性[ 5] , 这与有机肥料本身磷酸酶活性就 较高有关, 一般麦秸的碱性磷酸酶活性为 120. 2mg/ 100g, 猪粪为 79. 2mg/ 100g, 牛粪为 218. 4mg/ 100g, 都高于土壤碱性磷酸酶活性, 而且施入土壤后也能 刺激微生物的活性。因此, 施用有机肥料后土壤碱 性磷酸酶活性自然会增高。实验结果也证明了这一 点, 当施入麦秸 80g/ kg 土 10 天后, 土壤酸性磷酸酶 活性达到 104. 1mg/ 100g 土, 比 对照 53. 9mg/ 100g 土增加了 93. 1% , 中性磷酸 酶活 性比对 照增加 了 226. 4% , 碱性磷酸酶活性比对照增加了 19. 7% , 20 天后, 土壤酸性、中性、碱性磷酸酶活性分别比对照 增加了 96. 1% 、268. 9% 、5. 7% , 50 天土壤酸性、中 性、碱性与磷酸酶活性分别比对照增加了 160. 4% 、 346. 1% 、53. 9% 。施入猪粪 80g/ kg 土 10 天后, 土
可以作为土壤生物提供碳源, 也可以为土壤提供各 碱性磷酸酶活性与土壤有机质含量的相关系数分别
种矿质营养。因此, 土壤有机质含量高的土壤, 土壤 为 0. 9013、0. 9586 和 0. 8341, 均达到极显著相关。
微生物和土壤微生物 活性都较高[ 4] , 因此, 土 壤酶 说明土壤三种 形态磷酸酶活性与土壤 类型关系不
0. 11
20) 40
9. 7
0. 67
0. 09
40) 60
7. 2
0. 50
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）
1. 分析意义
土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理
Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制
a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；
b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；
c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇
溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；
d. 酚的标准溶液：
酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；
酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；
e. 甲苯；
f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：
取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、
0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
30min 后比色测定。
绘制标准曲线。
5. 试验步骤
5g 风干土置于200mL 三角瓶中，加2.5mL 甲苯，轻摇15min 后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h 。
后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。
吸取3mL 滤液于50mL 容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm 处比色。
6. 结果计算
磷酸酶活性，以24h 后1g 土壤中释放处的酚的毫克数表示。
1c ts mg g m
-⨯⨯⋅50酚（）＝ c －标准曲线上查得的酚浓度,mg ·mL -1；
50－显色液体积，mL ；
ts －分取倍数（这里是40＝（20+100）/3）
m －土壤质量，g 。
方法来源：关松荫. 土壤酶及其研究法. 北京: 农业出版社, 1986.。