发酵液预处理和固液分离
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发酵液预处理和固液分离
Hale Waihona Puke Baidu
预处理和固液分离内容
提取生化物质的第一步，分两部分：
发酵液
预处理
固液分离
胞外 上清液/滤液
胞内 富集细胞
第一节 发酵液过滤特性的改变
一、发酵液预处理的基本思路 二、预处理的目的 三、发酵液预处理的方法
一、发酵液预处理的基本思路
✓ 发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物， 及剩余的培养基残分等；
还能有效的除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液 的质量，因此絮凝与凝聚是目前工业上最常用的 预处理方法之一。
凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间扩散双电 层电位下降，电排斥作用降低，破坏胶体体系的分 散状态，使之不稳定相互凝集成1mm左右块状凝聚 体的现象。
蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质的相对分子质量在5*103-1*106之间，分
必要。 预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤
二、预处理的目的
预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的 速度，提高固液分离的效率：
（1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中 固体粒子的尺寸，降低液体黏度。
（2）相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价 无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
（3）尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多 数是液相）。
生物技术下游加工过程的一般步骤
三、发酵液预处理的方法
1. 加热法 （Heating） 2. 调节悬浮液的pH值（Regulation of pH） 3. 助滤剂和反应剂 （Filter aids and Reactant ) 4. 杂蛋白的去除（Removal of useless protein） 5. 高价无机离子的去除（Removal of inorganic ion） 6. 凝聚和絮凝（Coagulation and flocculation）
✓ 不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培 养液的固液分离，才能进行后续的操作；
✓ 对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从 澄清的滤液中提取代谢产物；
✓ 对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分 离，然后才能提取胞内产物。
发酵液的基本特性
1、发酵液成分复杂。 2、发酵产物浓度低，悬浮液中大部分是水。 3、悬浮物颗粒小，相对密度与液相差别不大。造成液相粘 度很大，不宜过滤。 4、菌体、蛋白等固体颗粒可压缩性大。 5、产物性质不稳定，随时间易发生变化，如氧化、污染、 蛋白质水解等作用的影响。 6、发酵液中含有色素、毒性物质、热源物质等，对产品的 质量安全及卫生标准产生不利影响。
0
0
6
12
18
Time,minutes
The effect on filtrate volume of pH
pH值的调整需要注意：
保护目的物活性，一般不宜过酸或过碱。 加酸或加碱时要慢慢地边加边搅拌，避免局部
浓度过高，引起目的产物变性。
3、凝聚 Coagulation
采用凝聚与絮凝技术能有效的改变细胞、细胞碎 片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较 大的颗粒，便于提高过滤速率。
1、降低液体的粘度
降低液体的粘度可以有效提高过滤的速率。
流体力学原理过滤速率与液体的粘度成反 比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。
常用方法有加水稀释和加热处理。
1）加水稀释
会增加悬浮液的体积，加大后续过程的处理任务。 稀释后的过滤速率提高的百分比必须大于加水比才
能有效。
2）加热
A、加热降低液体粘度 液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的 有效措施。
B、加热使蛋白质变性凝固，去除杂蛋白 变性蛋白质的溶解度小。
麦芽汁的黏度-温度曲线
麦芽汁40℃粘度为 12×10-3 升高至75℃其粘度 可下降一半以上，
过滤速率可加倍。
链霉素在pH3.0， 加热至70℃半
小时，粘度下 降1/6，过滤速 率可增大10-100
倍。
加热时必须严格控制温度和时间：
子直径约1-30nm，呈胶体性质; 蛋白质水化层：蛋白质分子周围存在与蛋白质
分子紧密或疏松结合的水化层。紧密结合的水 化层可达到0.35g/g蛋白质，而疏松结合的水化 层可达蛋白质分子质量的2倍以上； 静电排斥作用：
(1)胶体双电层结构
➢发酵液中菌体表面带 有负电荷，由于静电 引力使溶液中反离子 被吸附在其周围。 ➢正离子同时受到使它 们均匀分布的热运动 影响，具有离开胶粒 表面的趋势，在界面 上形成了双电层。
这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能
直接过滤； 若用高速离心，能耗很大，设备昂贵； 若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性
物质的存在也会影响固液分离。 寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分
两种相反作用力下，双电层分裂成两部： 1）吸附层（紧密层）；2）扩散层。 形成了扩散双电层的结构模型。
双电层可分为两部分：
紧密层：距胶核表面约一个离子半径的stern平 面以内，正离子被紧密结合在胶核表面，不流动。
分散层：紧密层外围反离子浓度逐渐降低直至达 到主体溶液的平均浓度。
滑移面：当胶体粒子在溶液中作相对运动时，总 有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚 度比吸附层稍大。
加热温度不能影响目的产物的活性及其他性质。 避免氧化、分解、变性等。
加热时间不能太长，否则会使细胞溶解，胞内 物质大量外溢，增加发酵液的复杂性，影响目 的产物的分离纯化。
2、调节pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当 调节pH值可改善其过滤特性。
细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋 于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的 有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。
通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质， 可减少膜堵塞和污染；
影响离子型絮凝剂的电离度。
pH 2.8
Filtrate Volume, cm3
pH 3.8 600
pH 4.2 400
200
pH 4.6
Hale Waihona Puke Baidu
预处理和固液分离内容
提取生化物质的第一步，分两部分：
发酵液
预处理
固液分离
胞外 上清液/滤液
胞内 富集细胞
第一节 发酵液过滤特性的改变
一、发酵液预处理的基本思路 二、预处理的目的 三、发酵液预处理的方法
一、发酵液预处理的基本思路
✓ 发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内外代谢产物， 及剩余的培养基残分等；
还能有效的除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液 的质量，因此絮凝与凝聚是目前工业上最常用的 预处理方法之一。
凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间扩散双电 层电位下降，电排斥作用降低，破坏胶体体系的分 散状态，使之不稳定相互凝集成1mm左右块状凝聚 体的现象。
蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质的相对分子质量在5*103-1*106之间，分
必要。 预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤
二、预处理的目的
预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的 速度，提高固液分离的效率：
（1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中 固体粒子的尺寸，降低液体黏度。
（2）相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价 无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
（3）尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多 数是液相）。
生物技术下游加工过程的一般步骤
三、发酵液预处理的方法
1. 加热法 （Heating） 2. 调节悬浮液的pH值（Regulation of pH） 3. 助滤剂和反应剂 （Filter aids and Reactant ) 4. 杂蛋白的去除（Removal of useless protein） 5. 高价无机离子的去除（Removal of inorganic ion） 6. 凝聚和絮凝（Coagulation and flocculation）
✓ 不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首先要进行培 养液的固液分离，才能进行后续的操作；
✓ 对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从 澄清的滤液中提取代谢产物；
✓ 对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分 离，然后才能提取胞内产物。
发酵液的基本特性
1、发酵液成分复杂。 2、发酵产物浓度低，悬浮液中大部分是水。 3、悬浮物颗粒小，相对密度与液相差别不大。造成液相粘 度很大，不宜过滤。 4、菌体、蛋白等固体颗粒可压缩性大。 5、产物性质不稳定，随时间易发生变化，如氧化、污染、 蛋白质水解等作用的影响。 6、发酵液中含有色素、毒性物质、热源物质等，对产品的 质量安全及卫生标准产生不利影响。
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Time,minutes
The effect on filtrate volume of pH
pH值的调整需要注意：
保护目的物活性，一般不宜过酸或过碱。 加酸或加碱时要慢慢地边加边搅拌，避免局部
浓度过高，引起目的产物变性。
3、凝聚 Coagulation
采用凝聚与絮凝技术能有效的改变细胞、细胞碎 片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较 大的颗粒，便于提高过滤速率。
1、降低液体的粘度
降低液体的粘度可以有效提高过滤的速率。
流体力学原理过滤速率与液体的粘度成反 比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。
常用方法有加水稀释和加热处理。
1）加水稀释
会增加悬浮液的体积，加大后续过程的处理任务。 稀释后的过滤速率提高的百分比必须大于加水比才
能有效。
2）加热
A、加热降低液体粘度 液体黏度是温度的指数函数，升温是降低黏度的 有效措施。
B、加热使蛋白质变性凝固，去除杂蛋白 变性蛋白质的溶解度小。
麦芽汁的黏度-温度曲线
麦芽汁40℃粘度为 12×10-3 升高至75℃其粘度 可下降一半以上，
过滤速率可加倍。
链霉素在pH3.0， 加热至70℃半
小时，粘度下 降1/6，过滤速 率可增大10-100
倍。
加热时必须严格控制温度和时间：
子直径约1-30nm，呈胶体性质; 蛋白质水化层：蛋白质分子周围存在与蛋白质
分子紧密或疏松结合的水化层。紧密结合的水 化层可达到0.35g/g蛋白质，而疏松结合的水化 层可达蛋白质分子质量的2倍以上； 静电排斥作用：
(1)胶体双电层结构
➢发酵液中菌体表面带 有负电荷，由于静电 引力使溶液中反离子 被吸附在其周围。 ➢正离子同时受到使它 们均匀分布的热运动 影响，具有离开胶粒 表面的趋势，在界面 上形成了双电层。
这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。
固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能
直接过滤； 若用高速离心，能耗很大，设备昂贵； 若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性
物质的存在也会影响固液分离。 寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分
两种相反作用力下，双电层分裂成两部： 1）吸附层（紧密层）；2）扩散层。 形成了扩散双电层的结构模型。
双电层可分为两部分：
紧密层：距胶核表面约一个离子半径的stern平 面以内，正离子被紧密结合在胶核表面，不流动。
分散层：紧密层外围反离子浓度逐渐降低直至达 到主体溶液的平均浓度。
滑移面：当胶体粒子在溶液中作相对运动时，总 有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚 度比吸附层稍大。
加热温度不能影响目的产物的活性及其他性质。 避免氧化、分解、变性等。
加热时间不能太长，否则会使细胞溶解，胞内 物质大量外溢，增加发酵液的复杂性，影响目 的产物的分离纯化。
2、调节pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当 调节pH值可改善其过滤特性。
细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋 于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的 有效方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。
通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质， 可减少膜堵塞和污染；
影响离子型絮凝剂的电离度。
pH 2.8
Filtrate Volume, cm3
pH 3.8 600
pH 4.2 400
200
pH 4.6