碱性磷酸酶染色(NAP)

碱性磷酸酶染色（NAP） 碱性磷酸酶染色（NAP）
掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、 目的 掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、 方法、注意事项和临床意义。 方法、注意事项和临床意义。 原理 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能水解 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6 pH9.6的碱性条件下能水解 磷酸萘酚，生成萘酚， 磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色 沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种， 沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚 牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。 牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。 RR BB
临床意义
临床上主要用于鉴别： 临床上主要用于鉴别： 1. 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(无继发性感染者 时，NAP积分一般明显下降， 慢性粒细胞白血病 无继发性感染者)时 积分一般明显下降， 无继发性感染者 积分一般明显下降 积分常＜ 分 甚至为零分；类白血病反应时则显著增高， 积分常＜13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积 分常＞ 分常＞200分。 分 2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高， 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病 情好转时， 积分则可逐渐下降。 情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 积分则可逐渐下降 3. 急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。 急性白血病的细胞类型： 增高， 下降。 增高 下降
方法步骤
干燥涂片用甲醇固定10min 待干。 10min， 1. 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。 染色30min 2. 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10 15min。 10～ 3. 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。 4. 流水冲洗，待干，镜检。 流水冲洗，待干，镜检。 5. 结果判断 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近， 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注
细胞外铁的划分标准: 细胞外铁的划分标准: (-)：无颗粒。 无颗粒。 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠( (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者 称为铁小珠) 称为铁小珠)。 (++)：有较多的铁颗粒或小珠。 (++)：有较多的铁颗粒或小珠。 (+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 (+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 (++++)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。 (++++)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。 铁粒幼细胞划分： 铁粒幼细胞划分： Ⅰ型：幼红细胞内含1～2个小铁颗粒。 幼红细胞内含1 个小铁颗粒。 Ⅱ型：幼红细胞内含3～5个小铁颗粒。 幼红细胞内含3 个小铁颗粒。 Ⅲ型：幼红细胞内含6～10个小铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。 幼红细胞内含6 10个小铁颗粒， 个小铁颗粒 个大铁颗粒。 Ⅳ型：幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒。 幼红细胞内含10个以上小铁颗粒， 10个以上小铁颗粒 个以上大铁颗粒。 环形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒＞ 环形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒＞6个，绕核2/3以上者。 绕核2/3以上者。 2/3以上者
方法步骤
新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s 流水轻轻冲洗30 10%甲醛甲醇固定液固定30s， 30～ 1. 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗30～ 60s，待干。 60s，待干。 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10 15min。 10～ 2. 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～15min。 3. 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲洗，待 流水冲洗1 2min，加苏木素染色液中复染5 8min，流水冲洗， 干，镜检。 镜检。 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 4. 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5 计算阳性率和积分值。 计算阳性率和积分值。
临床意义
1. 鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失， 鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血： 时骨髓细胞外铁显著减少或消失， 时骨髓细胞外铁显著减少或消失 铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以Ⅰ型为主， 型极少见， 铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见， Ⅲ型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断 型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多， IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的 及指导铁剂治疗的一种辅助方法； 及指导铁剂治疗的一种辅助方法 ， 、 、 等病人的 细胞外铁通常增高，内铁亦增高， 细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕 型为主，可以见到Ⅲ 与非IDA。 见Ⅳ型。因此，有助于鉴别IDA与非 因此，有助于鉴别 与非 。 2. 用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗 用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞， 颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。 颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。 3. 用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的 用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞＞15%。 ：骨髓中环形铁粒幼细胞＞ 。
注意事项
1. 磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适 磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多， 应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的 应的重氮盐， 关键。 关键。 2. 基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥 基质孵育液必须临用前新鲜配制， 后，才开始配制基质液。 才开始配制基质液。 3. 若无2-氨基 甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液 若无 氨基-2-甲基 丙二醇， 氨基 甲基 丙二醇 (pH9.2)或0.2mol/L Tris缓冲液 或 缓冲液(pH9.2)代替。 代替。 缓冲液 代替
铁染色（ 铁染色（Iron stain） ）
目的 掌握骨髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。 掌握骨髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。
原理
骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁， 经稀盐酸处理后而游离， 经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发 生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀， 生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含 铁的部位。细胞内铁也可用此法显示， 铁的部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱 可了解骨髓中铁的含量。 可了解骨髓中铁的含量。
注意事项
将新玻片用清洁液浸泡24h 24h， 1. 玻片需经去铁处理 将新玻片用清洁液浸泡24h，取出 后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5%盐酸 后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5%盐酸 95%酒精中24h 5% 中24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。 24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。 2. 骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材 骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒， 不佳时，往往影响结果。 不佳时，往往影响结果。 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。 3. 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 (3) 细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞， 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝 100个中
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色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、 色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、 大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。 大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。