定量PCR的实验步骤。
定量pcr的方法
定量pcr的方法定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种在实验室中常用的分子生物学技术，旨在定量测定DNA或RNA分子的相对丰度。
本文将详细介绍定量PCR的原理、操作步骤以及应用领域。
一、定量PCR的原理定量PCR的原理基于聚合酶链反应（PCR）技术，该技术通过复制模板DNA 或RNA分子的特定片段来实现特异性扩增，从而产生大量复制产物。
在定量PCR 中，引入一种特定的荧光探针，该荧光探针与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的数量与初始模板分子量成正比，因此可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR产物中的特定DNA或RNA分子序列的相对丰度。
二、定量PCR的操作步骤1. 制备PCR反应体系：将反应缓冲液、模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶、核苷酸和水混合制备反应体系。
反应体系中的核苷酸是用来提供DNA 或RNA的基本成分。
2. 热循环条件设置：选择合适的PCR仪，并设置合适的热循环条件。
热循环的三个步骤包括变性、退火和扩增。
3. 变性步骤：将反应体系加热至高温，通常为94-98，使DNA或RNA解性，即DNA双链分离，RNA变性为单链，使模板分子可供扩增。
4. 退火步骤：降低温度到引物特异性结合的温度，引物会与模板分子特异性结合，这通常在50-65之间进行。
5. 扩增步骤：将退火的反应体系加热至合适的温度，通常为72，此时聚合酶开始合成新的DNA链，延伸引物。
该步骤重复多次，每次扩增会产生两倍数量的DNA或RNA分子。
6. 荧光检测：在PCR反应进行过程中，荧光探针会与扩增产物结合，并在每个扩增周期的末端释放荧光信号。
荧光信号的强度与扩增产品的数量成正比。
7. 数据分析：使用特定的软件来分析荧光信号数据，将其转化为反应物的初始模板浓度。
可以通过比较不同样本的荧光信号强度来定量比较DNA或RNA的相对丰度。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
定量PCR的实验流程及注意事项
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
扩增子设计
● 扩增子长度：75-200bp ● 避免二级结构 ● 利用mFold 分析二级结构
借助熔解曲线分析结果
10,000 copies of input nucleic acid
80 copies
Amplicon
Nonspecific product
qPCR实验设计需要考虑的问题
● 绝对定量与相对定量 ● 使用SYBR或是Taqman探针 ● 对照组的设置 ● 标准品的选择 ● 看家基因的选择 ● 引物与探针的设计 ● 扩增子的设计 ● 实验循环条件的设计
好的引物及扩增子设计
● 提高扩增反应的效率 ● 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 ● 提高产量和灵敏度 ● 减少多重PCR的交叉影响
准确、可重复的结果
引物设计
● 避免二级结构 ● GC含量控制在50-60% ● 连续的G或C不超过3个碱基 ● 5’末端不含G
通过引物设计提高特异性
● BLAST ● 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 ● 进行多重PCR的可能 ● 测试多个引物对 ● 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对
未知样品 标准品梯度 阳性对照 阴性对照 基因组对照
● 校准生物学误差：看家基因 ● 降低其余误差： 样品重复实验
重复
● 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 ● 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） ● 理想的重复:
¾ 准备反应体系master mix, 包括样本 ¾ 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 ¾ 分装mix时使用一个枪头 ¾ 充分旋涡震荡5秒以上
环状RNA的定量PCR检测实验方法
环状RNA的定量PCR检测实验方法环状RNA（circular RNA）是一种具有闭合回路形态的RNA分子，与传统的线性RNA具有不同的生物学特性。
近年来，环状RNA受到广泛关注，研究者们致力于探索其在生物学过程中的功能和作用机制。
定量PCR是一种常用的检测方法，可以用于检测和定量环状RNA的表达水平。
下面将介绍一种常用的环状RNA定量PCR检测实验方法。
实验步骤如下：2.总RNA提取：使用RNA提取试剂盒提取样本的总RNA。
这种方法比较适用于含有较多RNA的组织样本。
使用RNA提取试剂盒可以快速、高效地提取RNA，同时避免RNase的污染。
3.线性RNA降解：使用RNase R酶可以选择性消化线性RNA，而保留环状RNA。
将提取的总RNA与RNase R酶一起反应，酶切后的线性RNA会被降解，而环状RNA则会保留下来。
4.反转录：将提取的总RNA转录成cDNA。
在这一步骤中，需要使用逆转录酶，同时加入随机引物或特异性引物，以促使cDNA的合成。
引物的选择很重要，可以使用特异性引物指向环状RNA的启动位点或者结合位点。
5.PCR扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增。
选择合适的引物进行PCR扩增，引物的设计要确保特异性，并且确保在一定的温度条件下能够提供较高的扩增效率。
6.分离和检测PCR产物：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其他适用的方法，分离PCR产物。
然后可以通过染色剂或者其他化学方法进行染色，以检测PCR产物的存在和相对丰度。
7.定量PCR分析：从PCR产物中选择相对稳定和特异的片段，进行定量PCR分析。
可以使用实时定量PCR方法，通过结合荧光探针或SYBR Green等荧光染料，测量PCR反应的信号。
通过与内参基因或标准曲线法进行定量分析，可以得到环状RNA的表达水平。
需要注意的是，由于环状RNA具有闭合回路的结构，其序列中不存在5'和3'端，因此在PCR扩增过程中需要特殊的引物设计和反转录方法。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
PCR实验室操作流程
PCR实验室操作流程PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种可以通过体外合成DNA的方法，也是现代生物技术中一项重要的分子生物学技术。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、基因突变检测、表达定量等。
下面是PCR实验室操作的一般流程。
1.设计引物：PCR实验的第一步是设计引物。
引物是用于扩增目标DNA片段的短链DNA序列。
两个引物分别对应目标序列的两端，其长度通常在18-24个碱基对之间。
引物的碱基序列必须与目标序列互补，以确保引物的结合和扩增特异性。
2. 制备PCR反应液：将PCR反应所需的试剂制备成PCR反应液。
PCR 反应液包括模板DNA、引物、聚合酶、反应缓冲液、dNTPs和Mg2+等。
聚合酶可以是常见的Taq聚合酶，也可以是其他高保真度的热稳定聚合酶。
反应缓冲液包含缓冲盐、pH调节剂和聚乙二醇等成分。
3.加热变性：PCR反应开始前，需要对DNA模板进行热变性，将其双链DNA解开成单链DNA，以供引物结合。
一般在95℃左右进行加热变性步骤，持续1-5分钟。
4.循环扩增：PCR实验主要包括循环扩增的步骤。
循环扩增主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
变性温度一般设置在94-98℃，可以使DNA双链变为单链；退火温度根据引物序列的特性来设计，一般设置在50-70℃之间，可以使引物与DNA模板序列结合；延伸温度一般为72℃，此温度下聚合酶能够合成新的DNA链。
5.PCR循环反复：PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸的三个步骤。
这样可以进行指数级扩增，生成大量目标DNA片段。
6. PCR产物检测：PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行检测。
将PCR产物与DNA分子量标记物一起电泳，可以通过与标准品比较得知扩增片段的大小。
也可以通过染色剂如SYBR Green等进行荧光定量，或者使用定量PCR方法定量扩增产物的数量。
7.结果分析和数据处理：根据PCR产物的结果进行数据分析和处理。
荧光定量PCR实验标准操作 SOP
荧光定量PCR实验操作SOP一、实验目的通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析。
二、实验准备：1. 进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR 操作实验室需紫外灯照射15 分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
2. 进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染。
3. 实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
4. 准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR 实验操作的耗材（要求无菌）1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml 离心管，用于荧光定量PCR 操作的试剂: 荧光定量PCR Master Mix、H2O，DNA 或cDNA 模板（注意必须在配制完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）.5. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
6. 实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、实验步骤：1. 荧光定量PCR MIX 的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix 按照20uL反应体系内容如下：Primer F: 0.8ul(0.4uM)Primer R: 0.8ul(0.4uM)2×TB Green Premix: 10ulROX: 0.4ulH2O: 6ulMIX Total: 18ulMIX配制通常准备10%冗余量。
2. MIX 配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA 小心加入装有反应液体的反应管内：DNA/cDNA Template: 2ul(<100ng)荧光定量PCR 反应总体积：20ul.3. 模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4. 严格按照荧光定量PCR 仪的操作手册启动仪器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR 扩增程序、荧光定量PCR 样品孔信息），保存文件，最好以日期及样品名称命。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
定量PCR的实验流程及注意事项
定量PCR的实验流程及注意事项一、实验流程：1. Primer设计：为了进行定量PCR实验，需要设计一对与目标DNA 或RNA序列特异性结合的引物。
确保引物的特异性和互补性，通过使引物的浓度相等可以最大限度地提高PCR反应的扩增效率。
2.模板DNA或RNA提取：从细胞或组织中提取目标DNA或RNA。
可以使用商业化的DNA/RNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
注意保持样品的完整性，避免污染和降解。
3.RNA逆转录（如果需要）：如果目标是RNA，则需要使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。
通常，使用逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
4. qPCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包含引物、模板DNA或cDNA、酶（如Taq DNA聚合酶、逆转录酶等）和反应缓冲溶液。
同时还可以加入SYBR Green等荧光染料或探针以实现实时监测PCR反应的进行。
5.PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，如温度和时间等。
通常情况下，PCR反应会进行多个循环，每个循环包括退火、延伸和变性三个步骤。
6.实时检测PCR反应：在PCR反应过程中，使用实时荧光检测系统实时监测PCR产物的积累。
根据荧光信号变化的阈值周期数（Ct值），可以推断出目标DNA或RNA的初始浓度。
7.标准曲线构建：通过使用已知浓度的目标DNA或RNA来构建标准曲线。
将标准曲线与待测样品的Ct值进行比较，可以计算出目标物浓度。
8.数据分析：根据标准曲线和待测样品的Ct值，计算出目标物的相对或绝对浓度。
可以使用专业的数据分析软件对实验结果进行统计分析和解释。
二、注意事项：1.特异性引物设计：确保引物与目标DNA或RNA的特异性结合，避免引物与非目标序列的扩增。
2.制备PCR反应的质量控制：采用无菌、无核酸污染的试剂和实验环境，避免引入杂质干扰PCR反应。
3.避免PCR反应产物的污染：使用专门用品和设备进行PCR实验，避免引入外源性DNA或RNA。
4.逆转录反应的标准化：如果进行RNA定量PCR，应尽量标准化逆转录反应的条件，以获得准确的cDNA模板。
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
实时荧光定量PCR仪操作流程
实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。
通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。
下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。
1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。
2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。
（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。
（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。
（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。
（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。
仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。
（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。
（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。
3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。
（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。
（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。
qpcr实验步骤详细
qpcr实验步骤详细引言real-time定量聚合酶链反应（qPCR）是一种快速、敏感并具有高度准确性的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、DNA定量和病原体检测等领域。
本文将详细介绍qPCR的实验步骤。
材料和试剂•qPCR仪器设备•PCR反应管•DNA模板•引物•DNA聚合酶•dNTP混合液•磷酸盐缓冲液•MgCl2•荧光探针•模板DNA稀释液实验步骤步骤1：实验室准备准备实验室工作台，并清洁工作台表面以消除任何潜在的污染源。
确保所有实验器材和试剂处于合适的工作温度。
步骤2：qPCR反应物的制备1.在干燥的PCR反应管中，向每个样品管中加入以下组分：•磷酸盐缓冲液：根据试剂盒说明书加入适量的磷酸盐缓冲液。
•dNTP混合液：加入适量的dNTP混合液。
•MgCl2：根据试剂盒说明书加入适量的MgCl2。
•引物：根据实验需要加入适量的引物。
•DNA聚合酶：根据试剂盒说明书加入适量的DNA聚合酶。
2.轻轻混合反应管，以确保所有反应物均匀混合。
步骤3：样品处理1.准备待测样品DNA。
可以通过提取DNA、RNA逆转录制备cDNA等方法获取。
2.将待测样品DNA加入PCR反应管中。
步骤4：qPCR条件设置1.预热qPCR仪器到适当的温度。
2.设置qPCR仪器的程序：•95°C：预热反应管，持续2-5分钟。
•95°C：变性步骤，持续15-30秒。
•Tm温度（引物特异性）：退火步骤，持续30秒-1分钟。
•72°C：延伸步骤，持续30秒-1分钟。
•重复步骤2-4，通常为25-40个循环。
步骤5：数据收集和分析1.使用qPCR仪器实时收集PCR数据。
2.通过仪器软件对数据进行分析。
结论经过上述步骤，我们可以成功进行qPCR实验。
这项技术可用于快速、准确地定量检测和分析DNA样品，对于研究基因表达调控、疾病诊断和药物研发等领域具有重要意义。
请注意，本篇文章是一种原创性的解释文章，旨在介绍qPCR实验步骤。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。
它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。
下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。
一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。
1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。
2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。
4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。
二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。
将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。
2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。
一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。
3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。
4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。
仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。
5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。
通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。
定量pcr的方法
定量pcr的方法
定量PCR（qPCR）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，用于准确测量目标DNA序列的数量。
定量PCR是通过测量PCR反应过程中产生的荧光信号的数量来实现的。
下面是定量PCR的步骤：
1. DNA模板准备：从样品中提取目标DNA，并通过DNA纯化方法去除任何污染物。
2. 引物设计：设计一对特异引物，其序列和目标DNA序列互补，并位于目标DNA的两侧。
3. 反应体系准备：准备PCR反应混合物，包括目标DNA模板、核苷酸混合物、引物、聚合酶和缓冲液。
4. PCR反应：使用热循环仪进行PCR反应，其中包括一系列温度变化的步骤。
这些步骤包括：变性（95C），引物结合（60C），延伸（72C），这些步骤的循环重复30-40次。
5. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，添加一个荧光标记的探针，该探针与目标DNA序列互补。
在每个PCR循环后，使用荧光检测系统测量荧光信号的强
度。
信号的强度与目标DNA的数量成正比。
6. 数据分析：根据荧光信号的强度，利用标准曲线法或比较阈值法确定目标DNA的浓度。
标准曲线法使用已知浓度的标准样品，通过荧光信号强度与目标DNA浓度的关系曲线来确定未知样品中目标DNA的浓度。
比较阈值法根据PCR 产物的周期阈值来判断目标DNA的存在和浓度。
定量PCR是一种灵敏和准确的方法，可用于检测和测量低浓度的目标DNA。
它广泛应用于基因表达分析、疾病诊断、食品安全和环境监测等领域。
实时定量PCR步骤
实时定量PCR步骤实时定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA序列或基因表达水平的方法。
它是PCR技术的变体，可以实时监测PCR反应的进行，并在放大过程中定量目标DNA序列的数量。
下面是实时定量PCR的详细步骤：步骤1：实验准备1.1收集所需的实验材料，包括PCR反应液组分（引物、探针、dNTPs、缓冲液、聚酶等）、PCR管和盖膜、模板DNA样品、阳性和阴性对照样品等。
1.2预先冷藏和解冻所有的试剂和样品。
1.3清洁操作台面，并准备离心机、实时荧光PCR仪和计算机等设备。
步骤2：引物和探针设计2.1根据待测目标序列，使用生物信息学工具设计引物和探针，确保具有高度特异性和高扩增效率。
2.2检查引物和探针的熔解温度是否相近，并避免二次结构和杂交问题。
步骤3：制备PCR反应液3.1根据PCR反应体系计算所需的试剂量，并根据实验板的数量和样品数量，按比例制备PCR反应液。
3.2在一个干净的离心管中，将缓冲液、dNTPs、引物、探针、酶和染料等反应组分按照特定顺序加入。
3.3使用纯水调整总反应体积，确保每个样品反应液体积相等。
步骤4：添加模板DNA4.1准备好模板DNA样品，可以是基因组DNA、cDNA或其他。
4.2将模板DNA分别加入各个PCR反应管中，注意避免污染和交叉污染。
步骤5：进行PCR反应5.1将PCR反应管密封，并在PCR仪上进行扩增。
此时，PCR仪应可提供实时荧光信号监测功能。
5.2设置PCR仪的温度程序和循环次数，通常包括热激活、扩增和延伸等不同的阶段。
5.3监测PCR仪上的实时荧光信号，并记录下所有的扩增曲线。
实时荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。
5.4在每个PCR循环的结束时，建议进行一次熔解曲线分析，以确定PCR产物的特异性。
步骤6：数据分析6.1使用PCR仪上的软件工具，导出扩增曲线数据。
6.2使用阈值周期（Ct）方法，根据扩增曲线与阈值线的交叉点来定量反应液中目标序列的数量。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR详细操作步骤1.实验前准备a.首先，准备所需的引物和探针。
引物是用于扩增待测DNA或RNA序列的短链DNA片段，而探针是荧光标记的DNA分子，用于标记和检测扩增产物。
可以使用商业引物和探针，或者设计自定义的引物和探针。
b.准备样品。
样品可以是DNA或RNA提取物，也可以是cDNA反应产物。
确保样品的质量和纯度，避免污染和降解。
c. 准备Master Mix。
Master Mix是一个预混合的反应液，包含引物、探针、核酸酶、逆转录酶、聚合酶和其他所需的试剂。
根据实验设计确定Master Mix的配方和浓度。
2.反应管设定a. 将适量的Master Mix加入每个反应管中。
根据实验设计，确定每个反应管中所需Master Mix的体积。
b.加入适量的模板DNA或RNA溶液。
根据实验设计，确定每个反应管中所需模板溶液的体积。
c.加入适量的引物和探针。
根据实验设计，确定每个反应管中所需引物和探针的体积。
d.加入适量的缓冲溶液和其他试剂。
根据实验设计，确定每个反应管中所需缓冲溶液和其他试剂的体积。
3.PCR程序设定a.设定PCR程序。
根据引物和探针的特性，确定PCR程序的温度和时间参数。
通常包括一个初始变性步骤（95°C，5分钟），40个循环的扩增步骤（95°C，30秒；温度调节，30秒；扩增，30秒-1分钟），以及最终的降温步骤（4°C或25°C）。
b.设定数据采集方式。
实时荧光定量PCR系统可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化，并实时记录和分析数据。
根据实验设计和PCR程序，选择合适的数据采集方式，在合适的时间点记录荧光信号。
4.实验操作a.将反应管安置在实时荧光定量PCR仪中。
确保反应管正确放置在PCR仪的样品槽中，并密封好。
b.启动PCR程序。
根据PCR仪的操作说明，启动PCR程序并开始反应。
c. 监测PCR反应过程。
实时观察PCR反应过程中的荧光信号变化。
PCR-DNA荧光定量实验步骤及注意事项
Slan+YMDD试剂操作PCR-DNA实验注意事项1．加样方面（混匀，不要有气泡，管壁上不要有液体）2．试剂方面（冷冻，不宜反复冻融超过3次；可分装）3．使用非肝素钠抗凝剂采血管4．实验室方面（实验做完注意通风、84清理台面、紫外线杀菌）5．注意污染（平常配试剂管盖的放置不要污染、加样时指甲及手套不要碰到管内壁）实验操作步骤1.室温融解2.取血清（或标准品）50ul 加入50ul 核酸提取液先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心一下（等离心机转速到了接近6000按停止）99度水煮或干浴10分钟，稍微弹碎；然后13000转离心10分钟保留上清液备用3.配混合液取N*36ul 混合液+ N*0.4ul TAQ酶混匀（先震荡混匀10秒然后6000转瞬间离心）（N为管数，实际上我们要取N+1 因为加样管壁上会沾液不多配会导致最后一个有误差例如有10个样本则取11*36+11*0.4；）4.取上述混合液36.5ul分别加入pcr反应管不要有气泡管壁不要有水珠5.加样取4ul上清液加入pcr管加样枪在液体里面反复打个7~8下最后在离心机稍微离一下6000转瞬间离心6.上机反应检查管壁水珠气泡实验结果方面1.标准曲线相关系数至少为-0.99 越小越好2.根据曲线分析结果（曲线是否稳，无波浪）38循环曲线抬头为阴性实线抬头曲线不抬头为YMDD变异（实线---病毒量虚线---判断有无变异）21个循环值大概为7次方后面加3.5个循环减少一个次方即24.5左右为6次方......上述操作不一定全正确，请自行参考各试剂厂试剂说明书以及检验方面相关资料此文本仅为学习方便之途，为Vrirus实验当中自己理解，与各位互相分享学习Virus编辑于2013解释权归Virus所有联系:ooo788@。
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定量PCR的实验步骤
一、标准曲线的标准DNA样品准备
1.将目的片段进行克隆，对克隆得到的阳性菌落进行质粒DNA的提取和纯化（试剂盒），纯化后的质粒DNA纯度用DO260/DO280的比值来鉴定，纯的DNA比值应该在1.8-1.9之间，如果比值大于1.9的时候表示有RNA污染，小于1.6的时候表示有蛋白质的污染（DO260的1OD值相当于50ng/ul的双链DNA 或33ng/ul的单链DNA或40ng/ul的RNA）；
2.采用紫外分光光度法（DO260 nm）测定质粒DNA的吸光度DO260值为A，（B=1DO260=50 ng/ul），由于载体质粒序列和插入的目标片段的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出单个质粒DNA （阳性质粒）的分子量C (ng/mol)，进而计算标准品的拷贝数D(copy/uL)：
拷贝数D=A×B
C
×6.02×1023(copy/ul)
3.将2步骤中计算出来的已知拷贝数的质粒DNA以10倍为梯度进行稀释，稀释7个系列（各个梯度的浓度一般为101～107），作为标准曲线的DNA模板；
二、未知样品的定量标定
模板质粒DNA每个梯度设置3个平行样。
未知样品设置2个平行样，同时设置一个没有质粒DNA的阴性对照。
（定量实验，误差是不可避免的，设立平行样，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小，以满足小样本统计的要求；确保数据的有效性，排除假阳性的干扰，必须设置阴性对照，阳性对照有标准样品就做，没有标准样品就可以省略不做）；
2.按照下面的程序进行荧光定量PCR反应：
95℃ 3 min
95℃10 s
58℃20 s 40个循环
72℃20 s
95℃30 s
58℃10 s 溶解曲线，并且在72℃和58℃时候读盘。
95℃
3.程序完成后进行溶解曲线分析，确定反应过程的特异性；同时用琼脂糖凝胶电泳对定量PCR的产物进行检验；
4.根据求得的未知样品中目的基因的拷贝数E( copy/ul)以及根据相关文献记载的单个细胞中含有的目标基因的拷贝数F（copy/cell，在相关的文献中能够找到假定的每个细胞中含有的目的基因的拷贝数），进而计算出单位样品中所含有的细胞当量数CEN：
CEN=E
F
(cell/ul)
这样既对目标基因进行了定量也对细胞数进行了定量（用细胞当量数表示）荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？
A、内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
B、荧光定量PCR无需内标定量
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，
得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。