AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析

AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析

本文介绍了AlphaScreen和AlphaLISA在基础药物研发研究和高通量筛选（HTS）方面的技术现状。AlphaScreen用于HTS

第二信使检测

Gs偶联的GPCR被激活后，可激活细胞内的cAMP 释放，并引起下游的信号转导。AlphaScreen技术用于cAMP检测采用了竞争性实验（Competition Assay），示意图如下：

反应体系内供体珠包被了亲和素，用于偶联上生物素化的cAMP；受体珠表面为anti-cAMP

抗体；通过生物素化的cAMP可将供体珠和受体珠拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。

将细胞裂解液加入反应体系内，胞内含有的游离cAMP同生物素化的cAMP竞争性结合抗体，体系产生的光信号降低。

蛋白激酶检测

蛋白激酶是一类磷酸转移酶，将ATP的磷酸基团转移至靶标底物。蛋白激酶主要分为2大家族，其中一族将磷酸基团转移至蛋白的酪氨酸残基上，称为酪氨酸激酶；另一族将磷酸基团转移至蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上，称为丝氨酸/苏氨酸激酶。

针对酪氨酸激酶检测，AlphaScreen利用了酪氨酸磷酸化抗体，这些特异性的抗体已偶联于受体珠表面。作为激酶作用的蛋白底物，已经过生物素化处理，能连接于供体珠表面。

激酶有活性状态下，利用蛋白底物的磷酸化基团能将供体珠与受体珠的距离拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。

通常意义上，丝氨酸/苏氨酸激酶特异性高于酪氨酸激酶，因此进行检测时，对于抗体的特异性要求更高。在这里，受体珠表面包被上Protein A（Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片断结合哺乳动物IgG），用于偶联鼠源或兔源磷酸化抗体；供体珠可以通过表面包被的亲和素偶联生物素化的磷酸化多肽或者是通过表面包被的谷胱甘肽（GSH）偶联GST标签蛋白底物。一旦多肽或蛋白底物被磷酸化，将拉近抗磷酸化抗体，产生光信号。

常见的激酶检测方法都需要特异性的抗体用于检测磷酸化多肽，新近又有一些方法采用Lewis 金属螯合物用于螯合底物上的磷酸基团。在这里，磷酸化的激酶底物可以通过生物素化或是加上GST标签而偶联在供体珠上，供体珠表面包被了Lewis金属螯合物。一旦磷酸化的底物被Lewis螯合将拉近供体珠和受

与同类型的检测方法TR-FRET、EFC和FP相比，AlphaScreen的优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物用于激酶检测。

另一些激酶检测方法则是将一对抗体对分别标记在供体珠和受体珠，与ELISA类似，形成双抗体夹心法。该检测方法最大的优势在于无需进行引物标记，检测灵敏度比ELISA方法更高。

如今，激酶检测技术朝着活细胞检测的方向发展，AlphaScreen在活细胞激酶检测有着独特的优势，可以检测内源底物的磷酸化状态。

蛋白酶检测

AlphaScreen已设计用来检测多种蛋白酶的活性，例如ADAM。供体珠和受体珠分别偶联了抗体针对蛋白多糖（aggrecan）的两个不同的抗体表位。当底物蛋白多糖结构完整的情况下，成对的珠子距离拉近，能产生光信号。当ADAM存在的情况下，能打断蛋白多糖的完整结构，光信号强度降低。类似的检测方法在小分子高通量筛选中应用很广泛。

蛋白底物被水解后，供体和受体珠分开，光信号强度降低

同传统的蛋白酶活性检测技术（例如，基于FRET的检测方法）比较，AlphaScreen优势在于能利用较大分子底物，尤其长片段蛋白底物上存在多个蛋白酶水解位点，而多肽片段只含有一个水解位点则会错失大量蛋白酶功能信息。

泛素化是一类翻译后的修饰，由E3连接酶家族调控，将导致目标蛋白的降解。研究已发现，E3连接酶活性的失调与多种疾病发生机理有关（如Alzheimer’s、Parkinson’s、癌症、炎症反应），因此E3连接酶是一类重要的药物靶标，传统的筛选技术通量低，并多采用免疫印迹技术。文献已报道使用AlphaScreen 技术筛选未知的E3连接酶底物，即经历泛素化修饰的未知靶标。该项目筛选连接酶Rsp5的底物，大量的未知底物加上GST标签，以此偶联上受体珠；体系中加入生物素化的泛素；如Rsp5能作用于底物时，将生物素化的泛素加上GST标签底物，供体珠亲和素-生物素偶联，将供体珠受体珠距离拉近，单体氧分子得以传递，产生光信号。利用该方法，此次项目中筛选得到大量首次得到的底物，后续的电泳胶实验和细胞毒性检测也证实了这些底物为Rsp5的泛素化靶点。

蛋白之间相互作用检测

很多细胞学检测涉及到复杂的蛋白之间相互作用，包括配体/GPCR结合，G蛋白偶联，激酶与底物结合，以及转录因子同激活子/抑制子之间的相互作用。

生长因子受体结合

以TNF受体超家族OX40受体为例，配体（OX40L）带有生物素标签将偶联至亲和素包被的供体珠；受体（OX40）以融合蛋白的形式连上IgG的部分Domain，以此偶联上Protein A包被的受体珠；当OX40L 与OX40结合后，将供体珠和受体珠距离拉近，单体氧分子得以传递，产生光信号。在实际高通量筛选中，已筛选出若干个抑制OX40L结合的小分子。

转录因子

AlphaScreen也同样用于转录因子和核内结合位点的结合，例如雌激素受体（ER）和steroid receptor

co-activator 1（SRC-1）。ER通过抗ER抗体偶联至受体珠，多肽片断（SRC-1）生物素化后偶联上供体珠。ER激活剂激活ER后将启动ER和SRC-1的相互作用，产生光信号。诸如上述，AlphaScreen技术用于受体的激活剂和抑制剂的高通量筛选。

病毒蛋白结合

传染性疾病的机理研究中病毒蛋白引起的细胞transformation和增殖。例如，人乳头瘤病毒（HPV）通过抑制p53活性，抑制细胞经历凋亡，是cervical癌症的主要致病因子。该过程中，HPV蛋白E6与泛素化连接酶E6AP而引发该过程。文献报道使用AlphaScreen检测E6和E6AP相互作用，以检测两者结合的抑制因子。检测体系中，E6-GST标签蛋白结合至受体珠，E6AP生物素化后连接至供体珠。通过该检测平台筛选了约3000种小分子并成功筛选出若干个先导物，并由后续实验证实。

AlphaLISA

目前，高通量的生物标志物筛选分析对于自动化检测仪器平台的要求较迫切，而目前常见的生物标志物分析技术为ELISA。ELISA技术不可避免地需要多个洗涤步骤，这需要自动化仪器的复杂编程，将增加成本并降低准确性。ELISA技术动态范围为2个数量级，多数情况下需要对样本进行多次稀释以达到ELISA检测的范围内。

AlphaLISA技术作为AlphaScreen的延伸，很好地满足生物标志物的高通量筛选需求。检测原理类似于双抗体夹心法，示意如下：