AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析
高通量筛选技术的进展和应用
高通量筛选技术的进展和应用高通量筛选技术指的是利用计算机和自动化设备来快速筛选出大量样品中的活性物质的技术。
它可以大大缩短筛选时间，提高筛选效率，有助于药物研发、酶学研究、蛋白质工程和生物工艺等领域的发展。
本文将从技术原理、应用领域和未来发展方向三个方面对高通量筛选技术进行探讨。
技术原理高通量筛选技术的关键在于快速筛选活性分子的方法。
一般来说，它由四个部分组成：样品处理、样品分割、样品测试和数据分析。
其中，样品处理主要是对待测样品进行处理，使其能够进行测试；样品分割是将处理后的样品均匀分配到各个测试单元中；样品测试是利用仪器对待测样品进行测试，获取其物理化学性质；数据分析则是将测试结果进行处理，得到筛选结果。
目前，高通量筛选技术主要有以下三种形式：分子马达筛选技术、化学结构库筛选技术和分子对接筛选技术。
分子马达筛选技术利用生物分子来获取数据。
例如，利用抗体来筛选抗体，利用脂肪酸来筛选肥胖症药物等。
化学结构库筛选技术则是将小分子化学结构存储在数据库中，并通过计算机程序对其进行筛选和预测。
分子对接筛选技术则是将小分子和受体结合在一起，并通过计算机程序对其进行对接和筛选。
应用领域高通量筛选技术在生物医学领域有着广泛的应用。
它可以用来研究代谢疾病、癌症、感染疾病、心血管疾病等疾病的发病机制和药物治疗的机理。
在药物研发方面，高通量筛选技术可以用来筛选出具有治疗效果的药物，快速确定药效和剂量，提高药物研发的效率。
在蛋白质工程方面，该技术可以用来改变或增强蛋白质的性质，扩大其用途范围，提高其活性和稳定性。
在生物工艺方面，该技术可以用来优化微生物菌株，提高产物产率和质量，降低生产成本。
未来发展方向高通量筛选技术的发展方向是更加智能化和自主化。
未来的高通量筛选技术将能够自动完成样品处理、分割、测试和数据分析，大大提高筛选效率，降低人力成本。
此外，高通量筛选技术的发展还将会与人工智能技术相结合，实现更加准确和高效的筛选结果。
高通量测序技术的应用及进展
高通量测序技术的应用及进展高通量测序技术是指一种能够快速、准确测定DNA序列的技术。
该技术的应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。
本文将介绍高通量测序技术的基本原理、应用领域和近期的进展。
一、高通量测序技术的基本原理高通量测序技术基于DNA文库构建和DNA测序两个核心步骤。
首先，从样品中提取DNA并将其断裂成小片段，然后将这些DNA片段与特定的引物连接起来，形成DNA文库。
接下来，将这些文库片段进行PCR扩增，然后可以将其上机测序。
目前，常用的高通量测序技术主要包括Illumina HiSeq、PacBio、IonTorrent 等。
Illumina HiSeq是目前最常用的高通量测序技术之一。
它通过将DNA文库的小片段固定在阵列上，使得多个文库可以同时测序。
在这个过程中，短的DNA片段依次通过不同的步骤进行读取，并通过计算机算法组装成全长DNA序列。
由于其高速、高效、高准确性和低成本等优越特性，Illumina HiSeq已成为目前世界上最主要的高通量测序技术之一。
二、高通量测序技术的应用领域1.基因组学高通量测序技术可以加速对不同物种整个基因组的测序。
通过对不同物种基因组序列的比对和分析，可以帮助研究者了解基因功能和物种间进化关系，从而探究生命系统和生态系统的演变和发展。
2.转录组学高通量测序技术可以测定生物在某一特定条件下的全部转录本（Transcriptome）的信息，揭示了基因表达调控的分子机制。
通过分析转录本谱系，我们可以研究这些基因的生物学功能，并了解物种对于外界因素（如环境、激素等）的反应机制。
3.表观基因组学高通量测序技术可以对基因组中——甲基化修饰、组蛋白修饰、染色体构像等表观遗传学信息进行测序，并探究相关功能和机制。
4.个体化医学高通量测序技术可以帮助研究者快速获取个体基因组的信息，并探究不同基因组差异与疾病的关系。
通过辨识不同基因型和疾病关联的遗传变异信息，我们能更好地诊断、治疗和预防疾病。
AlphaScreenLisa标记检测仪的技术需求
AlphaScreen/Lisa标记检测仪的技术需求1. 设备名称：AlphaScreen/Lisa标记检测仪2. 主要用途：检测各种微孔板中物质的荧光、荧光、吸收光的强度等，适用细胞或蛋白为基础的分析：细胞增殖和细胞毒性分析。
结合分析检测：受体结合测定，GTP 结合测定，免疫测定。
特别适合于用于药物分子的结构优化筛选和微量激素/蛋白检测，药物作用的分子机理和药物筛选的方法开发和研究，适合于创新的研究应用。
3. 工作条件：电压：110-250 VAC；环境温度：15-25℃；相对湿度：15-70%4. 技术指标：4.1 硬件：4.1.1 有AlphaScreen、AlphaLisa检测功能；*4.1.2 光源系统：激光用于测量AlphaScreen；*4.1.3 四光栅，光栅带度（激发，发射）：5nm，步进精度：0.1nm；4.1.4 四光栅波长范围：230-850nm；4.1.5 有UV/VIS光吸收检测、可做ELISA和DNA\蛋白定量；4.1.6 适用于6~384孔的各种微孔板、Petri培养皿、标准玻片、滤膜、 Terasaki 培养板和PCR样；4.1.7 样品板可以通过振荡器三种运动形式（线性、椭圆形和8字形）进行样品的混匀；4.1.8 温度控制范围：RT+3℃～65℃，检测器PMT恒温25℃，可有效降低检测时因PMT温度改变引起的读数干扰；4.1.9 内置电脑极方便的触摸屏，可带手套操作；*4.1.10 投标时必需提供厂家的合法授权书。
4.2 软件：4.2.1 控制软件对同一样品板可以自动连续300次测量，每次测量之间的最大时间设置为3600秒；4.2.2 控制软件的测量顺序可以设定为按孔测定或按列测定；4.2.3 有Pre-coded分析程序；4.2.4 数据分析软件包括以下功能：curve fit(lin-reg, spline, 4PL/5PL), background subtraction, ratio calculation, IC50 calculation, Average, CV% and Z-value；4.2.5 兼容Windows Vistar操作系统；4.2.6 数据可以Excel/text的格式保存到电脑或USB接口的U盘。
药物筛选方法
药物筛选的方法分子水平筛选Microbead FCM联合筛选原理：FCM（流式细胞术）（flow cytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。
由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。
应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。
蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
主要用于检测大分子和大分子相互作用。
放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理：（1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+ Ab（特异性抗体） - AgAb*Ag（标记抗原）+ Ab（特异性抗体）- *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）应用：（1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等（2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素等（3）非激素蛋白质的测定，酶，药物及维生素，免疫分子等的测定。
药物筛选方法
药物筛选的方法分子水平筛选Microbead FCM联合筛选原理：FCM（流式细胞术）（flow cytometry）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，它可以根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离细胞。
由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体或抗体结合，利用和细胞大小相似的Microbead作为固相载体取代细胞通过FCM，不同荧光标记的Microbead就被分离出来，于是靶分子或目标分子就很容易的被分离、纯化。
应用：Lanza等利用这项技术测定了患有脊髓发育不良综合症和急性骨髓源白血病病人体内的各种细胞因子受体CR表达量的变化。
蛋白质-蛋白质；蛋白质-RNA相互作用。
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）原理：它是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
应用：免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和MS质谱分析鉴定准备样品，常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
主要用于检测大分子和大分子相互作用。
放射免疫性检测（RIA）（与EIA，FIA相比灵敏度更高，但由于放射性元素，RIA的使用受到了限制）原理：（1）竞争结合分析：Ag（非标记抗原）+ Ab（特异性抗体） - AgAb*Ag（标记抗原）+ Ab（特异性抗体）- *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）应用：（1）肿瘤相关抗原的测定：AFP，CEA，CA199，CA125，CA153，CA724，CYFRA211，PSA等（2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素等（3）非激素蛋白质的测定，酶，药物及维生素，免疫分子等的测定。
高通量检测技术的进展与应用
高通量检测技术的进展与应用随着全球人口的不断增长、环境的恶化以及人类身体健康问题的日益严重，如何快速、准确地检测病原体已成为科学家们研究的重点。
高通量检测技术的应用可为这一问题提供一个有效解决方案。
高通量检测技术是一种将大量样本快速分析和检测的方法，它可以检测DNA、RNA、蛋白质等生物分子，广泛应用于医学、环境、食品、生态等领域。
近年来，随着生物技术、计算机技术和材料科学等领域的不断发展，高通量检测技术也得到了迅速的发展，不断地提高着检测效率和准确度。
一、高通量检测技术的分类目前高通量检测技术主要包括基因芯片技术、单细胞测序技术和质谱分析技术等三种。
其中，基因芯片技术是将上万个基因片段固定在芯片上，实现对不同基因的快速分析和检测；单细胞测序技术是将单个细胞逐个分离出来进行测序，从而获取不同细胞之间的遗传差异；而质谱分析技术是利用质谱仪对样本中的分子进行分析和检测。
二、高通量检测技术的应用高通量检测技术在医学、环境、食品、生态等领域有着广泛的应用。
在医学上，高通量检测技术可用于病原体的检测、新药的开发、个体化医疗等方面，在环境监测中，高通量检测技术可用于水、土壤、空气及生态系统的污染监测和生物多样性检测，而在食品检测领域，高通量检测技术可用于食品安全的检测、鉴别和溯源等方面。
三、高通量检测技术的进展与展望高通量检测技术的发展使检测速度和效率大大提高，同时，精度和准确度也得到了保障。
未来，高通量检测技术将会在治疗癌症、检测新型病毒等方面得到更广泛的应用。
同时，本技术的进一步研究和应用也将为生物领域的发展开创新的道路。
综上所述，高通量检测技术的出现为世界带来了极大的变化和进步。
随着技术的不断发展，它将成为未来研究人员的重要工具，为人类健康和环境保护等问题提供更加可靠和高效的解决方案。
高通量抗体筛选技术及其生物医药应用
高通量抗体筛选技术及其生物医药应用随着人类对生命科学的研究不断加深，抗体药物已成为现代医药学领域的一颗耀眼明珠。
然而，传统的抗体生产方式极为费时费力，大大限制了抗体药物的应用和生产效率。
随着科技的不断进步，高通量抗体筛选技术应运而生，成为推动抗体医药发展的重要工具之一。
本文将分析高通量抗体筛选技术的发展趋势、研究进展及其在生物医药领域中的应用。
一、高通量抗体筛选技术高通量抗体筛选技术，又称高通量筛选法（High-throughput screening），是指利用高通量方法筛选出具有活性的抗体或其他生物分子的技术。
高通量抗体筛选技术的优势在于可以同时处理大量样本，快速筛选出具有较高药效和特异性的抗体前体，提高药物发现的效率和速度，使药物研究和开发更加高效。
高通量抗体筛选技术发展至今，已经广泛应用于各种科学研究和生物医药领域，尤其在癌症、自身免疫性疾病、感染疾病等领域中拥有广泛应用的前景。
二、高通量抗体筛选技术的研究进展1. 抗体库技术抗体库技术是高通量抗体筛选技术的一种重要方法，通过对大量的抗体库进行筛选，识别具有独特活性的抗体药物。
例如公司Lilly开发了利用嵌入式技术制备Phage显示的人源单抗库，并在此基础上发展了一种新型的抗体药物，用于治疗肿瘤和自身免疫性疾病。
2. 突变技术突变技术是指通过诱发抗体的突变，从而得到具有改良性能的抗体药物。
突变技术通常包括分子演化技术、DNA乱序技术、遗传突变技术等。
通过此类技术可以实现抗体药物在亲和力、特异性、稳定性等方面的优化，从而获得更为理想的抗体药物。
3. 体外和体内选择技术体外和体内选择技术是指通过体外/体内选择的方式筛选出具有特殊功能的抗体药物。
此类技术不仅可以识别出具有特殊生物活性的抗体药物，同时还可以评估和优化已经发现的抗体药物。
三、高通量抗体筛选技术的生物医药应用1. 抗体药物目前，抗体药物已成为生物医药领域最重要的药物之一。
抗体药物通过模拟人体免疫系统的作用机制，能够与病原体或癌细胞表面的分子结构结合，从而发挥诊断和治疗作用。
高通量筛选法新进展与应用前景展望
高通量筛选法新进展与应用前景展望摘要：高通量筛选法是一种快速、高效的筛选方法，日益受到科学界的关注和重视。
本文将介绍高通量筛选法的概念和原理，重点探讨了新进展和应用前景。
高通量筛选法在药物研发、材料科学和生物学领域都有广泛的应用前景。
一、引言高通量筛选法是在分子库中通过自动化系统进行大规模寻找目标分子的筛选方法。
它能够在较短的时间内筛选出大量可能的候选物质，加速了研发过程。
近年来，随着技术的进步和研究方法的创新，高通量筛选法在药物研发、材料科学和生物学领域得到了广泛应用。
二、高通量筛选法的原理高通量筛选法是基于分子识别的原理，通过寻找目标分子与候选物质的相互作用来筛选合适的化合物。
其基本步骤包括目标选择、分子库构建、筛选过程和结果验证。
1. 目标选择目标选择是高通量筛选法的第一步，根据研究的对象和研究的目的，确定要筛选的目标分子。
例如，在药物研发中，可以选择与特定疾病相关的蛋白质作为目标分子。
2. 分子库构建分子库是高通量筛选法的核心，它包含大量可能的化合物。
分子库的构建可以通过合成化学方法合成或从天然产物中提取。
近年来，计算机辅助药物设计和化学合成方法的进步使得分子库的规模和多样性得到了大幅提升。
3. 筛选过程筛选过程通常采用高通量自动化设备进行，该设备能够高效地处理大量样本。
常见的筛选方法包括体外酶活性检测、细胞功能检测和生物传感器等。
研究人员可以根据具体需求选择合适的筛选方法。
4. 结果验证筛选结束后，需要对筛选出的化合物进行进一步的验证。
验证方法可以通过分子对接、动物模型和临床实验等。
这些验证方法可以评估化合物的活性、选择性和毒性，从而确定是否具备进一步研发的潜力。
三、新进展与应用前景高通量筛选法在过去几十年中取得了显著的进展，并在药物研发、材料科学和生物学等方面发挥了重要作用。
1. 药物研发高通量筛选法在药物研发中有广泛应用，可以快速筛选出具有潜力的药物候选物。
通过高通量筛选法，研究人员可以筛选出具有特定活性的化合物，加速药物研发过程。
AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析
AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析本文介绍了AlphaScreen和AlphaLISA在基础药物研发研究和高通量筛选（HTS）方面的技术现状。
AlphaScreen用于HTS第二信使检测Gs偶联的GPCR被激活后，可激活细胞内的cAMP 释放，并引起下游的信号转导。
AlphaScreen技术用于cAMP检测采用了竞争性实验（Competition Assay），示意图如下：反应体系内供体珠包被了亲和素，用于偶联上生物素化的cAMP；受体珠表面为anti-cAMP抗体；通过生物素化的cAMP可将供体珠和受体珠拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。
将细胞裂解液加入反应体系内，胞内含有的游离cAMP同生物素化的cAMP竞争性结合抗体，体系产生的光信号降低。
蛋白激酶检测蛋白激酶是一类磷酸转移酶，将ATP的磷酸基团转移至靶标底物。
蛋白激酶主要分为2大家族，其中一族将磷酸基团转移至蛋白的酪氨酸残基上，称为酪氨酸激酶；另一族将磷酸基团转移至蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上，称为丝氨酸/苏氨酸激酶。
针对酪氨酸激酶检测，AlphaScreen利用了酪氨酸磷酸化抗体，这些特异性的抗体已偶联于受体珠表面。
作为激酶作用的蛋白底物，已经过生物素化处理，能连接于供体珠表面。
激酶有活性状态下，利用蛋白底物的磷酸化基团能将供体珠与受体珠的距离拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。
通常意义上，丝氨酸/苏氨酸激酶特异性高于酪氨酸激酶，因此进行检测时，对于抗体的特异性要求更高。
在这里，受体珠表面包被上Protein A（Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片断结合哺乳动物IgG），用于偶联鼠源或兔源磷酸化抗体；供体珠可以通过表面包被的亲和素偶联生物素化的磷酸化多肽或者是通过表面包被的谷胱甘肽（GSH）偶联GST标签蛋白底物。
一旦多肽或蛋白底物被磷酸化，将拉近抗磷酸化抗体，产生光信号。
高通量测序技术的进展与应用
高通量测序技术的进展与应用高通量测序技术是目前生物学领域中最广泛应用的一项技术，其在生命科学研究和医学诊断、治疗中有着不可替代的作用。
本文将从高通量测序技术的发展历程、技术原理、应用领域和未来趋势方面进行探讨。
一、发展历程高通量测序技术的发展可以追溯到上世纪的80年代。
当时，首个基于PCR技术的DNA测序方法问世，为分子生物学领域带来了重大变革。
1990年前后，Sanger测序技术被广泛应用于基因组测序和位点分析，这项技术开创了20世纪末的基因组学时代。
但是，由于Sanger测序技术需要耗费大量时间和成本，并且无法适应大规模测序的需要，因此新的高通量测序技术应运而生。
2005年，第一代高通量测序技术（454测序技术）问世，它可以同时测序多个DNA分子，实现了快速和大规模的DNA测序。
此后，Illumina、Ion Torrent、PacBio等公司也推出了各自的高通量测序平台，其样本并行测序的能力比前一代增加了一百多倍。
二、技术原理高通量测序技术的核心原理是基于DNA构建数百万条文库片段，利用芯片封装技术，在特定反应条件下，通过DNA合成和缩并等过程，以独立片段的形式测序，最终得到数十亿条测序数据。
根据不同公司或技术平台的测序原理和放大方式，可以将高通量测序技术分为四大类：Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Nanopore测序。
Illumina测序：基于桥扩增和双端测序的原理。
将DNA分子分解成片段，连接到芯片上的相应网格内。
反复复制这些片断，进行桥样PCR扩增，得到簇集。
簇集上每个DNA分子的两端被同步测序，测序所得的碱基被反复合成，最终得到拼接的读取结果。
Illumina测序的特点是高通量、低成本、高准确度。
Ion Torrent测序：基于半导体芯片检测技术的原理。
将DNA分子分成片段，扩增成DNA簇集，添加碱基到半导体芯片表面，将引物与硫酸缓冲液加至芯片内部。
高通量筛选技术在抗体药物研发中的应用
高通量筛选技术在抗体药物研发中的应用概述抗体药物是一种重要的生物制剂，具有高度特异性和亲合性，因而广泛应用于临床治疗。
然而，传统的抗体药物研发流程长、成本高，并且难以满足对大规模产出的需求。
为了克服这些问题，高通量筛选技术应运而生，成为近年来抗体药物研发领域的重要工具。
本文将探讨高通量筛选技术在抗体药物研发中的应用。
一、背景随着基因工程和蛋白质工程技术的不断进步，抗体药物已成为治疗多种疾病的重要手段之一。
传统的抗体药物开发过程包括目标选择、阳性选择、阴性选择和功能验证等步骤。
然而，这种流程耗时耗力，并且效率较低。
二、高通量筛选技术及原理1. 相关概念介绍：高通量筛选是指利用自动化设备对复杂样品进行快速分析处理并获取大量数据的技术手段。
在抗体药物研发中，高通量筛选技术主要包括核酸编码显示（mRNA display）、蛋白质编码显示（protein display）和细胞表面显示等。
2. 核酸编码显示技术：核酸编码显示是一种通过与目标结合的核酸序列对应的蛋白质进行筛选的方法。
通过引入两段不同序列的“连接子”来将每个目标特异性分子与其对应的mRNA或cDNA联系起来，从而实现快速筛选和识别。
3. 蛋白质编码显示技术：蛋白质编码显示是一种通过与目标结合的蛋白质序列对应的核酸进行筛选的方法。
它将融合了密码子和译者区域的DNA片段关联到其相应融合蛋白上，并通过PCR扩增、转录和转化等步骤实现了高通量筛选。
4. 细胞表面显示技术：细胞表面显示是将外源多肽分子固定到细胞表面，使得细胞可以直接与配体结合。
它常用于发现具有高亲和力、高选择性及特异性等特征的抗体。
三、高通量筛选技术在抗体药物研发中的应用1. 快速筛选具有高亲和力的候选药物：高通量筛选技术能够加速对大规模样本进行筛选，识别出具有高亲和力的候选药物。
这种技术使得研究人员可以快速评价大量样本的效果，并从中选择最合适的抗体。
2. 提高抗体生产效率：传统的抗体生产过程常常需要耗费大量时间和资源，而高通量筛选技术可通过自动化设备实现大规模、并行化抗体表达和纯化。
第二信使环腺苷酸和环鸟苷酸检测方法研究进展
第二信使环腺苷酸和环鸟苷酸检测方法研究进展王友升;王胜杰;马国为【摘要】3＇,5＇-环腺苷酸（cAMP）和3＇,5＇-环鸟苷酸（cGMP）是真核细胞内常见的调节众多功能的第二信使,最近以cAMP/cGMP信号通路为靶点研发的功能食品也越来越多,因此检测cAMP/cGMP的含量至关重要。
介绍了放射性同位素法、均相非放射性同位素法、非均相非同位素法等近年来广泛使用的cAMP/cGMP检测方法的原理及其实际应用情况,分析了各种方法的优缺点及灵敏度。
其中,荧光共振能量转移技术、均相时间分辨荧光共振能量转移技术、极化荧光检测技术等均相非放射性同位素法因其操作便捷、特异性强、灵敏度高而适用于cAMP/cGMP的高通量检测。
【期刊名称】《食品科学技术学报》【年(卷),期】2017(035)006【总页数】8页(P48-54)【关键词】cAMP;cGMP;检测方法;灵敏度【作者】王友升;王胜杰;马国为【作者单位】北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/食品质量与安全北京实验室/北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京100048;北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/食品质量与安全北京实验室/北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京100048;北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/食品质量与安全北京实验室/北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京100048【正文语种】中文【中图分类】TS201.43′,5′-环腺苷酸(cAMP)和3′,5′-环鸟苷酸(cGMP)是细胞内常见的调节众多功能的第二信使，通过开放离子通道来调节基因表达，进而调节众多机体生理功能[1]。
据报道，白藜芦醇[2]、茶多酚[3-4]、皂苷、花青素等许多食品功能因子通过直接或间接影响cAMP/cGMP信号通路来发挥其功效。
研究对cAMP/cGMP信号通路的影响首先需要检测cAMP/cGMP，因其水平变化对解析相关食品功能因子的作用机理有一定的实际意义，尤其是需要借助高通筛选技术来筛选相关的食品功能因子。
证明三个蛋白互作的方法
证明三个蛋白互作的方法在生物学研究中，蛋白质之间的相互作用是细胞内许多生物过程的核心。
了解三个蛋白之间的互作关系对于揭示复杂的信号传导网络和代谢途径至关重要。
本文将详细介绍几种用于证明三个蛋白互作的方法。
一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
通过将三个待研究的蛋白质分别与酵母转录因子的DNA结合域和激活域融合，构建酵母双杂交载体。
将这些载体共转化到酵母细胞中，若三个蛋白质之间存在互作，则可以观察到报告基因的激活。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种用于检测蛋白质相互作用的常用方法。
首先，将细胞裂解并提取蛋白质，然后利用特异性抗体捕获其中一个蛋白质，与其互作的蛋白质也会被一同沉淀下来。
通过检测沉淀物中的其他两个蛋白质，可以证明三个蛋白质之间的互作关系。
三、双分子荧光互补法（BiFC）双分子荧光互补法是基于荧光共振能量转移（FRET）原理的一种方法。
将三个蛋白质分别与荧光蛋白的N端和C端融合，构建表达载体。
当三个蛋白质互作时，荧光蛋白的N端和C端相互靠近，恢复荧光信号。
通过观察荧光信号的变化，可以证明三个蛋白质之间的互作。
四、分裂荧光素酶互补法（SFC）分裂荧光素酶互补法与双分子荧光互补法类似，但使用的是荧光素酶。
将三个蛋白质分别与荧光素酶的N端和C端融合，构建表达载体。
当三个蛋白质互作时，荧光素酶的N端和C端相互靠近，恢复荧光素酶活性。
通过检测荧光素酶活性，可以判断三个蛋白质之间的互作。
五、阿尔法互作陷阱法（AlphaScreen）阿尔法互作陷阱法是一种基于荧光共振能量转移原理的高通量筛选方法。
通过将三个蛋白质分别与供体和受体荧光蛋白融合，构建表达载体。
当三个蛋白质互作时，供体和受体荧光蛋白相互靠近，发生能量转移，产生可检测的荧光信号。
六、蛋白质芯片法蛋白质芯片法是一种基于微阵列技术的蛋白质相互作用研究方法。
将三个蛋白质分别固定在芯片上的不同位置，然后与标记的蛋白质混合。
如何使用高通量技术对基因进行筛查
如何使用高通量技术对基因进行筛查随着现代生物技术的发展，DNA测序技术不断推陈出新。
现在，高通量测序技术已经成为了基因测序的主流。
高通量测序技术可以高效、精准、快速地进行基因测序，大大提高了我们对基因的认识和研究。
在本文中，我们将探讨如何使用高通量技术对基因进行筛查。
一、高通量测序技术的基本原理高通量测序技术是指在同一时间内进行大量的DNA分析，通过扩大分析范围，来加速DNA序列的测定速度和降低成本。
根据测序原理的不同，高通量测序技术有以下几种：1.链终止法：该方法是1986年由斯里兰卡的谢科尔斯基组研发出来的。
该方法需要使用标记有不同荧光染料的4种dNTP（即ATCG），在DNA合成过程中加入。
DNA链延伸到有某个dNTP的位置后，该荧光染料就会释放出荧光信号标记位置的碱基。
通过监测这些荧光信号，就可以突破测序速度和通量的瓶颈。
2.桥接PCR法：该方法是将DNA片段接到测序板上，然后通过PCR反应来产生许多DNA链，最后进行荧光检测。
该方法能在不断增加测序片段的同时，也能提高质量、稳定性和重复性。
3.扩增桥接法：该方法是将DNA片段连接成桥，并逐一地进行扩增。
可形成数百万个DNA片段，然后通过荧光标记的方法检测DNA片段测序。
4.纳米孔法：该方法是利用原子层沉积技术在纳米空间中制备出纳米孔。
DNA分子通过这些孔，来逐个被检测和测序。
五、如何使用高通量技术对基因进行筛查1.基因组测序：基因组测序是高通量测序技术的主要应用之一。
该技术可以对整个基因进行测序，包括所有编码和非编码区域。
通过比较两个不同人的基因组序列，我们可以找到其差异，从而帮助我们理解人类基因的多样性和基因在足迹中的重要性。
2.转录组测序：转录组是指在一个特定细胞或组织的基因表达水平。
通过利用转录组测序技术，我们可以得到组织中所有表达的核糖核酸序列，从而研究基因的表达模式和功能。
3.外显子组测序：外显子是基因组中的编码蛋白序列的区域。
酶标仪alpha检测原理
酶标仪alpha检测原理酶标仪alpha（AlphaScreen）是一种基于放射性同位素的酶标技术。
它利用酶和底物之间的特异性结合，通过检测酶催化反应所产生的信号来定量分析样品中的目标物质。
酶标仪alpha的检测原理是基于化学和光学的原理。
首先，样品中的目标物质与与之特异性结合的底物结合，形成复合物。
然后，将一种特殊的底物添加到体系中，该底物被酶催化后会产生一种特殊的化学反应。
该化学反应会导致光子的释放，这些光子通过非辐射性能量传递（FRET）的方式传递给另一种底物上，激发该底物上的荧光素分子发出荧光。
最后，通过检测样品中发出的荧光信号的强度，可以确定样品中目标物质的浓度。
酶标仪alpha的优点在于其敏感性高、准确性好和灵敏度强。
它可以用于检测各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
同时，酶标仪alpha还可以应用于多种实验方法，如酶抑制实验、受体配体结合实验、酶活性测定等。
酶标仪alpha的应用范围非常广泛。
在生物医学研究中，它可以用于疾病标志物的检测和生物分子的定量分析。
在药物研发过程中，酶标仪alpha可以用于筛选药物靶点和评估药物的活性。
在环境监测和食品安全领域，酶标仪alpha可以用于检测有害物质的含量和食品中的残留物。
然而，酶标仪alpha也存在一些限制。
首先，它需要使用专门设计的底物和试剂盒，这增加了实验的成本。
其次，酶标仪alpha需要较长的反应时间，通常需要数小时甚至数天。
此外，酶标仪alpha 对样品的要求比较严格，需要较高纯度的样品和精确的实验条件。
酶标仪alpha是一种常用的生物分析工具，它通过检测酶催化反应所产生的信号来定量分析样品中的目标物质。
它具有敏感性高、准确性好和灵敏度强的优点，并且可以应用于多种实验方法和研究领域。
然而，酶标仪alpha也存在一些限制，需要使用专门的试剂和较长的反应时间。
随着技术的不断发展，酶标仪alpha有望在生物医学研究和药物研发中发挥更大的作用。
高通量筛选技术的应用和进展
高通量筛选技术的应用和进展随着生物科技领域的不断进步和创新，高通量筛选技术成为了生物学领域中最重要的工具之一。
高通量筛选技术能够对大量的分子进行筛选和分析，在生物学研究和药物开发中发挥着极为重要的作用。
它的发展和应用，已经极大地推动了生物学和药物研发领域的进步。
一、高通量筛选技术的应用高通量筛选技术的应用范围非常广泛，除了药物研发之外，还包括了生物学、微生物学、化学等领域。
在药物研发中，高通量筛选技术被广泛应用，可以用于筛选药物活性成分、药物靶标、药物分子、药物运输物等。
在生物学中，高通量筛选技术可以用于筛选分子上的糖基化修饰、分离蛋白质复合物、分析蛋白质-蛋白质相互作用等。
同时，高通量筛选技术也被广泛应用于微生物学领域，可以用于寻找新的微生物生物活性成分以及寻找氧化还原过程中参与的蛋白质、酶和代谢产物等。
此外，高通量筛选技术还被广泛应用于化学领域，可以用于寻找新药物化合物、分析药物作用机制、寻找新的抗生素等。
总的来说，高通量筛选技术的应用领域非常广泛，正日益发展壮大。
二、高通量筛选技术的进展高通量筛选技术的发展离不开科学家们对各种技术的不断创新和改进。
下面简要介绍高通量筛选技术的进展。
1、光学筛选技术的发展光学筛选技术是目前应用广泛的筛选技术之一，可以测量光谱吸收度或荧光强度来确定分子的特异性。
随着近年来新型光学筛选技术的不断创新，光学筛选技术的分辨率和准确性得到了极大的提高，为高通量筛选技术的发展奠定了坚实的基础。
2、纳米技术的应用纳米技术在生物学和医学研究领域中的应用越来越广泛，因为它可以帮助科学家更准确地观察细胞和分子。
纳米技术的应用使得高通量筛选技术的灵敏度和分辨率得到了极大的提升，同时还使得一些原本不易检测的物质能够被检测出来。
3、计算机技术的进步高通量筛选技术的应用需要依靠复杂的计算机程序和软件，随着计算机技术的不断发展，高通量筛选技术的计算能力也得以不断提升。
现在的高通量筛选技术已经可以处理数以万计的样品，并自动分析和总结数据，大大提高了研究效率。
人工智能在高通量筛选中的应用
人工智能在高通量筛选中的应用近年来，随着科技的不断发展，人工智能技术也得到了巨大的发展与应用。
其中，在高通量筛选中，人工智能技术的应用也变得越来越广泛。
高通量筛选是指在大量小分子或药物中，通过高效率的筛选方式，寻找目标分子或药物的过程。
这种技术的应用范围非常广泛，包括农业、医药等多个领域。
而人工智能技术则为高通量筛选提供了更多的可能性。
一、人工智能在高通量筛选中的应用在高通量筛选中，人工智能技术主要应用于以下几个方面：1、模拟药物分子的互动过程目前的高通量筛选技术并不能真正模拟药物分子在人体内的互动过程。
而人工智能技术则可以利用深度学习等技术，准确地模拟药物分子在人体内的互动过程，并帮助更加精准地筛选潜在的药物分子。
2、辅助药物分子的研发在药物研发过程中，需要进行大量的实验和测试。
而传统的实验测试方式非常耗时，需要花费大量的人力和物力。
而人工智能技术则可以为药物研发提供便捷的方法，如利用机器学习技术对大量药物数据进行分析，快速筛选出可能有价值的物质，大大提高药物研发效率和成功率。
3、优化高通量筛选技术人工智能技术可以帮助优化高通量筛选过程中的一些参数，如筛选条件、分子大小、药效等。
通过对这些参数的优化，可以得到更加精准的筛选结果，为药物开发提供更多参考。
二、人工智能技术的优势人工智能技术在高通量筛选中的应用，主要有以下优势：1、提高筛选效率传统的高通量筛选需要大量的时间和人力，而人工智能技术可以高效地完成这个过程，大大提高了筛选效率。
一般来说，采用人工智能技术进行高通量筛选，可以节省70%以上的时间和资源。
2、提高筛选准确度人工智能技术可以模拟药物分子在体内的互动情况，比传统的高通量筛选技术有更高的准确度。
例如，在药物筛选中，采用人工智能技术，可以缩小筛选范围，大大提高了筛选准确度。
3、降低成本采用人工智能技术进行高通量筛选，可以降低成本。
传统的高通量筛选需要大量的人力和资源，而利用人工智能技术，可以节省这些资源，降低成本。
高通量筛选技术在抗病毒药物发现中的应用
高通量筛选技术在抗病毒药物发现中的应用病毒感染是人类面临的一个重要健康问题，尤其在病毒性疾病大流行的时期，预防和治疗病毒感染变得尤为重要。
病毒感染的治疗主要使用抗病毒药物，然而传统的药物筛选方式存在着许多的局限性和缺陷，而高通量筛选技术正是解决这些问题的利器之一。
高通量筛选技术是在大量的化合物中高效地筛选出具有特定活性的化合物的一种现代技术。
在药物发现中，该技术能够帮助研究人员快速高效地筛选出合适的药物候选化合物。
在抗病毒药物领域中，高通量筛选技术广泛应用于筛选具有抗病毒作用的化合物，从而寻找新的抗病毒药物。
其中，最重要的一点是对该技术的理解和运用。
高通量筛选技术的优势高通量筛选技术相较于传统的药物筛选技术，在抗病毒药物发现中有着更明显的优势。
首先，该技术能够高效地进行药物筛选。
传统的药物筛选需要人工筛选和鉴定，耗时长且效率低。
而高通量筛选技术具有较高的筛选效率，能够同时筛选大量的化合物，从而大大提高了筛选的效率和准确率。
其次，高通量筛选技术可以应用于多种不同类型的病毒。
病毒的种类非常多，不同的病毒在感染机理等方面均有所不同。
高通量筛选技术可以通过改变筛选条件来满足不同种类的病毒。
除此之外，高通量筛选技术可以提供更准确的数据。
该技术利用大量的机器和仪器进行数据采集和分析，相比传统的观察和实验数据更可靠。
高通量筛选技术的应用高通量筛选技术在抗病毒药物发现中的应用是多方面的，下面主要讨论其中的几个方面。
1. 通过高通量筛选技术来发现新的药物靶点。
病毒感染的机制比较复杂，有的药物靶点容易破坏，而有的则比较难以被有效破坏。
高通量筛选技术可以通过对体内或体外的病毒和宿主细胞的化合物筛选，快速发现新的药物靶点从而研发出新的药物。
2. 高通量筛选技术在药物库的筛选中的应用高通量筛选技术可以较快地筛选出药物库中具有活性的化合物，从而在寻找新的抗病毒药物的过程中可以快速排除或者确认一些已有的化合物。
3. 高通量筛选技术在了解化合物的作用机理和毒性中的应用高通量筛选技术可以通过对病毒与化合物的相互作用进行观察和分析，进行数据挖掘，以了解化合物是否具有良好的安全性和应用前景，避免在实际应用中出现一些不可预知的不良反应和风险。
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AlphaScreen技术在高通量筛选研究的现况分析
本文介绍了AlphaScreen和AlphaLISA在基础药物研发研究和高通量筛选（HTS）方面的技术现状。
AlphaScreen用于HTS
第二信使检测
Gs偶联的GPCR被激活后，可激活细胞内的cAMP 释放，并引起下游的信号转导。
AlphaScreen技术用于cAMP检测采用了竞争性实验（Competition Assay），示意图如下：
反应体系内供体珠包被了亲和素，用于偶联上生物素化的cAMP；受体珠表面为anti-cAMP
抗体；通过生物素化的cAMP可将供体珠和受体珠拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。
将细胞裂解液加入反应体系内，胞内含有的游离cAMP同生物素化的cAMP竞争性结合抗体，体系产生的光信号降低。
蛋白激酶检测
蛋白激酶是一类磷酸转移酶，将ATP的磷酸基团转移至靶标底物。
蛋白激酶主要分为2大家族，其中一族将磷酸基团转移至蛋白的酪氨酸残基上，称为酪氨酸激酶；另一族将磷酸基团转移至蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基上，称为丝氨酸/苏氨酸激酶。
针对酪氨酸激酶检测，AlphaScreen利用了酪氨酸磷酸化抗体，这些特异性的抗体已偶联于受体珠表面。
作为激酶作用的蛋白底物，已经过生物素化处理，能连接于供体珠表面。
激酶有活性状态下，利用蛋白底物的磷酸化基团能将供体珠与受体珠的距离拉近，单体氧分子得以传递至受体珠，发生化学反应，产生光信号。
通常意义上，丝氨酸/苏氨酸激酶特异性高于酪氨酸激酶，因此进行检测时，对于抗体的特异性要求更高。
在这里，受体珠表面包被上Protein A（Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片断结合哺乳动物IgG），用于偶联鼠源或兔源磷酸化抗体；供体珠可以通过表面包被的亲和素偶联生物素化的磷酸化多肽或者是通过表面包被的谷胱甘肽（GSH）偶联GST标签蛋白底物。
一旦多肽或蛋白底物被磷酸化，将拉近抗磷酸化抗体，产生光信号。
常见的激酶检测方法都需要特异性的抗体用于检测磷酸化多肽，新近又有一些方法采用Lewis 金属螯合物用于螯合底物上的磷酸基团。
在这里，磷酸化的激酶底物可以通过生物素化或是加上GST标签而偶联在供体珠上，供体珠表面包被了Lewis金属螯合物。
一旦磷酸化的底物被Lewis螯合将拉近供体珠和受
与同类型的检测方法TR-FRET、EFC和FP相比，AlphaScreen的优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物用于激酶检测。
另一些激酶检测方法则是将一对抗体对分别标记在供体珠和受体珠，与ELISA类似，形成双抗体夹心法。
该检测方法最大的优势在于无需进行引物标记，检测灵敏度比ELISA方法更高。
如今，激酶检测技术朝着活细胞检测的方向发展，AlphaScreen在活细胞激酶检测有着独特的优势，可以检测内源底物的磷酸化状态。
蛋白酶检测
AlphaScreen已设计用来检测多种蛋白酶的活性，例如ADAM。
供体珠和受体珠分别偶联了抗体针对蛋白多糖（aggrecan）的两个不同的抗体表位。
当底物蛋白多糖结构完整的情况下，成对的珠子距离拉近，能产生光信号。
当ADAM存在的情况下，能打断蛋白多糖的完整结构，光信号强度降低。
类似的检测方法在小分子高通量筛选中应用很广泛。
蛋白底物被水解后，供体和受体珠分开，光信号强度降低
同传统的蛋白酶活性检测技术（例如，基于FRET的检测方法）比较，AlphaScreen优势在于能利用较大分子底物，尤其长片段蛋白底物上存在多个蛋白酶水解位点，而多肽片段只含有一个水解位点则会错失大量蛋白酶功能信息。
泛素化是一类翻译后的修饰，由E3连接酶家族调控，将导致目标蛋白的降解。
研究已发现，E3连接酶活性的失调与多种疾病发生机理有关（如Alzheimer’s、Parkinson’s、癌症、炎症反应），因此E3连接酶是一类重要的药物靶标，传统的筛选技术通量低，并多采用免疫印迹技术。
文献已报道使用AlphaScreen 技术筛选未知的E3连接酶底物，即经历泛素化修饰的未知靶标。
该项目筛选连接酶Rsp5的底物，大量的未知底物加上GST标签，以此偶联上受体珠；体系中加入生物素化的泛素；如Rsp5能作用于底物时，将生物素化的泛素加上GST标签底物，供体珠亲和素-生物素偶联，将供体珠受体珠距离拉近，单体氧分子得以传递，产生光信号。
利用该方法，此次项目中筛选得到大量首次得到的底物，后续的电泳胶实验和细胞毒性检测也证实了这些底物为Rsp5的泛素化靶点。
蛋白之间相互作用检测
很多细胞学检测涉及到复杂的蛋白之间相互作用，包括配体/GPCR结合，G蛋白偶联，激酶与底物结合，以及转录因子同激活子/抑制子之间的相互作用。
生长因子受体结合
以TNF受体超家族OX40受体为例，配体（OX40L）带有生物素标签将偶联至亲和素包被的供体珠；受体（OX40）以融合蛋白的形式连上IgG的部分Domain，以此偶联上Protein A包被的受体珠；当OX40L 与OX40结合后，将供体珠和受体珠距离拉近，单体氧分子得以传递，产生光信号。
在实际高通量筛选中，已筛选出若干个抑制OX40L结合的小分子。
转录因子
AlphaScreen也同样用于转录因子和核内结合位点的结合，例如雌激素受体（ER）和steroid receptor
co-activator 1（SRC-1）。
ER通过抗ER抗体偶联至受体珠，多肽片断（SRC-1）生物素化后偶联上供体珠。
ER激活剂激活ER后将启动ER和SRC-1的相互作用，产生光信号。
诸如上述，AlphaScreen技术用于受体的激活剂和抑制剂的高通量筛选。
病毒蛋白结合
传染性疾病的机理研究中病毒蛋白引起的细胞transformation和增殖。
例如，人乳头瘤病毒（HPV）通过抑制p53活性，抑制细胞经历凋亡，是cervical癌症的主要致病因子。
该过程中，HPV蛋白E6与泛素化连接酶E6AP而引发该过程。
文献报道使用AlphaScreen检测E6和E6AP相互作用，以检测两者结合的抑制因子。
检测体系中，E6-GST标签蛋白结合至受体珠，E6AP生物素化后连接至供体珠。
通过该检测平台筛选了约3000种小分子并成功筛选出若干个先导物，并由后续实验证实。
AlphaLISA
目前，高通量的生物标志物筛选分析对于自动化检测仪器平台的要求较迫切，而目前常见的生物标志物分析技术为ELISA。
ELISA技术不可避免地需要多个洗涤步骤，这需要自动化仪器的复杂编程，将增加成本并降低准确性。
ELISA技术动态范围为2个数量级，多数情况下需要对样本进行多次稀释以达到ELISA检测的范围内。
AlphaLISA技术作为AlphaScreen的延伸，很好地满足生物标志物的高通量筛选需求。
检测原理类似于双抗体夹心法，示意如下：
与ELISA相比，AlphaLISA具有下述特点：
传统ELISA AlphaLISA
特异性高高
灵敏度灵敏（皮摩尔水平）高灵敏（亚皮摩尔）
检测特性非匀相，需要多次洗涤匀相，无需洗涤
人力非常耗人力人力需求非常少
高通量实现高通量较困难容易实现微型化
抗体需求需要高亲和度的抗体可以使用高亲和/低亲和力抗体
上样体系大，50~100μl小，< 5μl
检测范围有限（2个数量级）大（4个）
仪器需求普通微孔板Alpha检测特殊仪器，需要激光器
总结
任何技术都是一把双刃剑，有优势也有限制，AlphaScreen/AlphaLISA技术也不例外。
AlphaScreen技术主要的限制在于反应体系对于强光或是长时间的室内光敏感；其次，某些化合物对于单体氧分子的捕获会降低光信号；供体珠光漂白效应使得信号检测以单次为佳。
与ECL、FMAT技术相似，AlphaScreen也需要高能激光器；同其他技术相比，AlphaScreen对于检测仪器平台有要求。
AlphaScreen技术主要优势在于待测物质的范围宽泛，从小分子到大型复合物；均相体系、快速、稳定，灵敏度更高；AlphaScreen检测也不需要荧光标签的引入，避免了空间位阻影响生物分子的相互结合；可用于检测生物学粗提物例如细胞裂解物、血清、血浆、体液等，而不会影响测读效果。