基因工程与微生物

基因工程与微生物基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

一、基因工程的概况基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。

所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。

是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

它克服了远缘杂交的不亲和障碍。

1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。

2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程二、基因工程的基本步骤（1）提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如植物的抗病（抗病毒抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。

要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。

科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。

鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。

如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有两条。

一条途径是以目的基因转录成的信使RNA 为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。

另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

（2）目的基因与运载体结合基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。

如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。

然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。

将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

（3）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。

目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。

基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。

用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

（4）目的基因的检测和表达目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

这是基因工程的第四步工作。

以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。

因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。

检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

三、微生物学与基因工程的关系微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。

从以下六个方面可以说明：①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。

五、微生物与克隆载体外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制和扩增。

这种以扩增外源DNA为目的的载体，称为克隆载体(cloning vector) 。

（1）克隆载体的要求。

①能够进行独立自主复制；②具有若干限制酶的单一切割位点；③具有可供选择的遗传标记；④载体DNA易于生长和操作。

（2）微生物作为克隆载体的宿主。

对于克隆基因而讲，一个理想宿主的基本要求是：①能够高效吸收外源DNA。

②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统。

③不具有限制修饰系统。

④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型菌株，是克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。

⑤便于进行基因操作和筛选。

⑥具有安全性。

（3）载体的类型:质粒载体；λ噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体。

六、基因工程在微生物研究中的应用基因工程技术作为微生物学研究的重要手段，有力促进了微生物学基础理论研究的发展。

分子克隆和构建工程菌对了解微生物的结构与功能、微生物生理与代谢调节以及微生物生态等基本过程，提供了最好方式。

通过分子克隆、限制内切酶图谱以及DNA测序等技术，使遗传学家能够快速绘制并研究微生物的基因组。

利用克隆基因进行定位诱变、基因分裂（gene disruption）或敲除突变（knockout mutations），并使这些突变基因导入到微生物染色体中，有助于对突变微生物进行的研究。

基因工程技术使科学家能够给某个基因贴上"标签"（tag），以便于对该基因进行研究。

例如编码β-半乳糖苷酶的基因通常被用于作为一个报导基因，它的酶活性可通过含呈色物质的指示平板而被检测。

另一个例子是，将发光细菌（photobacterium）的细菌荧光素酶或者发光甲虫（beetles）的虫萤光素酶（luciferase）基因导入E.coli。

当这些基因表达时，在琼脂平板上人们可以发现E.coli工程菌的发光菌落。

测定荧光素酶需要加入ATP和荧光素。

最近从一种维多利亚水母（Aequorea victoria）分离并克隆了编码绿色萤光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的基因，GFP不需要辅助因子，在许多生物学研究中已被用作为报导者或"标签"。

七、基因工程研究展望基因工程的兴起导致生物科学发生深刻的变化，主要表现在：第一，引发了生物科学中技术上的创新和迅猛发展。

使传统生物技术，发展成以基因重组技术为核心的现代生物技术，即简称为生物技术。

生物技术用于工程实践而形成了各类生物工程，主要包括基因工程、酶工程、细胞工程、发酵工程和生化工程等，其中以基因工程发展最快，应用最广。

第二，技术上的重大突破，促使生物科学获得前所末有的高速度发展，开辟了新的研究领域，进入了新的研究深度。

发育分子生物学、神经分子生物学、分子细胞学、分子生理学、分子进化学等学科领域的蓬勃发展。

第三，为改造生物提供强有力的手段，使生物学进入创造性的新时期。

从而使得在分子水平上重新设计、改造和创建新的生物形态和新的生物物种成为可能。

基因工程能够带来的好处是十分巨大的。

以上叙述仅涉及制药、农业和医学领域的某些方面。

其实，基因工程的应用范围要广泛得多，在食品、化工、环保、采矿、冶炼、材料、能源等众多领域都有诱人的开发前景。

它将在人类实践中发挥更大作用和贡献。

当然，它也和其它所有新生事物一样，在它给人们带来巨大利益的同时也面临着严峻的挑战。

基因工程与传统生物技术的最根本的区别就在于前者是在基因水平上进行操作，改变已有的基因甚至创造新的物种，这是一项前无古人的崭新的工作。

因此，基因工程是否具有潜在的危害性，特别是转移至人体的基因是否会激活原癌基因，基因工程是否会导致出现新型病原生物等问题必然也成为人们关心和争议的焦点，也是当前的研究热点之一。

但有一点可以肯定，人们既然能发明一种新技术，必然也将会有能力掌握这门新技术，使它朝着人类进步的方向发展。