以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

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[方案]组织工程人造皮肤

[方案]组织工程人造皮肤组织工程人造皮肤1 组织工程人造皮肤重要性皮肤是人体的重要器官之一，在60天内可完全更新一次。

皮肤不仅能使人不受到污物或细菌的侵袭，也能保持人体内的水分不致逃逸。

当大面积的皮肤受到严重的烧伤或损害，医生必须立即输入液体并保护伤口，如果仅是皮肤的浅层受损，新皮肤会再生。

如果病人受到了严重的烧伤，皮肤就不能靠自己修复。

长期以来，人们对严重的皮肤缺损创面，只能靠切取自体正常部位的皮肤移植修复，尽管能治愈创面，但在取皮部位却留下了新的创伤，常常导致疤痕增生，甚至因取皮过深，供皮区难以自愈，形成水疱，反复溃疡，导致“好了旧伤又添新疤”。

据介绍，遇到大面积严重烧伤的病人，如果其正常皮肤所剩无几，缺乏自体皮源及时封闭创面，常常引起创面及全身严重的感染等一系列并发症，有可能危机生命。

因此，国际医学界一直试图在体外制造一种皮肤代用品，用来更换人体损坏的皮肤组织。

过去，能让重度烧伤病人活下来的，在100人中只有22人;用了人造皮肤后，增加到64人。

负面作用是，人造皮肤固然挽救了生命，但也带来感染，有时人体还会对它作出不良反应:结成很硬的疤。

今天，人造皮肤用于皮肤移植的第一期治疗。

人造皮肤保护伤口免受感染，并促进结缔组织的生长。

人体的免疫系统会逐渐分解多聚物，一旦病人自己的表层皮肤被植上以后，伤口会很快愈合。

2 组织工程人造皮肤研究历史临床上对组织器官的大量需求,促进了组织工程研究及其产业的快速发展。

美国、欧洲、日本、新加坡和韩国,是世界上组织工程研究最为发达的国家和地区。

美国在组织工程领域处于世界领先地位,早在1988年就以基金的形式资助了组织工程的系列研究课题。

2001年美国成立了组织工程学会，并逐渐形成全球性的学术组织。

据统计，1995年,2002年，组织工程领域累计投入45亿美元，产业的综合规模年扩增率为11%。

到2002年底，16个国家从事组织工程产业的公司有89 家、人数达2611人。

体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展

ｇｏｈｆｃｏ，ＧＦ等，到既促进增殖又抑制分化ｒｗｔａｔｒＳ）起的双重作用。
饲养层细胞的来源与筛选
验证实维持ＥＣ的效果可靠，仍有自身弊端［：１Ｓ但３（）］小鼠来源的饲养层细胞可能给培养体系带来异种蛋白和遗传物质，引起不良反应；２小鼠源性饲养层可（）能会引入小鼠携带的病原微生物，造成污染；３通常（）
需定期制备，大了ＥＣ培养的工作量和经济负担；加Ｓ且随着传代的增加，生长活性和分泌ＬＦＦ其Ｉ、ＧＦ等
因子的能力将逐渐下降；同时饲养层细胞种类发生变
制备的条件培养基；３以人胚胎成纤维细胞、人输（）成
化，利于深入分析其成分；４成纤维细胞耐硫代鸟不（）嘌呤和耐乌本苷亚系由于长期体外培养，色体已发染
生畸变，能有效地抑制ＥＣ的分化和维持ＥＣ的不ＳＳ
二倍体核型。
来源于人或鼠的饲养层制备并添加细胞外基质以保持人ＥＣ的所有特性，２种培养体系避免了人ＥＣＳ这Ｓ与饲养层直接接触，但仍有不足：１培养体系仍存在（）
卵管上皮细胞、包皮成纤维细胞、宫内膜基质细胞、子小鼠成纤维细胞等为来源的饲养层。前２种体系又称无饲养层培养体系。无血清无饲养层培养体系需添加各种细胞因子和血清替代品，件培养基需要条

皮肤组织工程学的研究与应用

皮肤组织工程学的研究与应用一、引言皮肤组织工程学是关于皮肤再生、修复和再生的研究领域。

它以原生皮肤为模板，利用基因和细胞工程技术构建人工皮肤组织，促进人体皮肤伤口的愈合和病变的治疗。

近年来，随着科学技术的发展和人类生活水平的提高，皮肤组织工程学在组织工程领域中逐渐成为一个独立的研究领域。

本文旨在对皮肤组织工程学的研究和应用进行介绍和探讨。

二、皮肤组织工程学的基本理论皮肤组织工程学基于组织工程学、生物学和材料科学等学科理论研究。

其基本理论包括三个方面：1.细胞工程和材料工程学理论组织工程学的核心理论之一是细胞工程学。

细胞工程学研究的是利用体外培养的细胞作为起源，在合适的环境中，通过种种手段促进其增殖和分化，构建人工组织和人工器官的过程。

在皮肤组织工程学中，细胞和材料的选择是关键因素。

目前，干细胞和成体细胞的再生技术还不能满足需要，因此皮肤组织工程学目前主要以成纤维细胞、角质细胞等表皮细胞为研究对象，经过细胞培养、分化、组织工程、生物降解、自愈合和生物学性能评价等多个环节构建人工皮肤。

2.组织工程学理论组织工程学理论是指利用细胞、材料和生物技术等手段，再生、重建和修复人体组织和器官的一种理论体系。

当皮肤遭受创伤后，通过细胞的移植和生物材料的使用，可以促进皮肤组织的修复和再生。

3.材料科学理论皮肤组织工程学使用的材料包括支架材料、材料复合体、生物材料和人工材料。

材料科学理论应用是规范和把握这些材料的性能及其对皮肤组织再生的促进作用，对皮肤组织工程学的技术发展和研究具有十分重要的意义。

三、皮肤组织工程学的主要应用皮肤组织工程学是一个专业的研究领域，其应用主要体现在以下几个方面：1.美容及皮肤病治疗利用组织工程技术制造新的皮肤可用于治疗皮肤创伤、晒伤、慢性溃疡、烧伤等皮肤病。

目前，纯化皮肤干细胞并运用皮肤组织工程技术，实现了精准分化，制备了具有与自然皮肤相似结构和功能的人工皮肤。

相比于传统的稀疏的人工皮肤，这些新的人工皮肤对外伤和疾病的治疗可有效且快速。

国内外干细胞牛人简介

榜样的力量是无穷的。

每个领域都有取得杰出成就的成功人士，他们也是后生崇拜学习的偶像。

科研领域也不例外。

作为目前最热门的研究领域--干细胞，该领域的大牛都有谁？他们都在做什么？笔者总结了一下这个领域的牛人，分为国际篇、华人篇和国内篇三部分介绍。

本文仅代表笔者的个人观点，欢迎补充。

7 s2 z3 p- Z5 f. {) w/ n: l5 ]) ]3 ], I' c! f一、国际篇( Z2 S! S; q5 t, K& F) [+ S2 b! m2 L& u6 t. w8 s) j2 p山中伸弥（Shinya Yamanaka）# n5 D& A- m% v- Z5年前，提起Shinya Yamanaka，可能只有做胚胎干细胞的人略有耳闻，而现在他的名字在科研领域可谓是家喻户晓。

虽然在iPS之前，他也做出了一些重要的工作，如发现Nanog 和Eras在小鼠胚胎干细胞中的作用(2003，Cell；2003，Nature)，但这些跟iPS相比，再好的工作光芒都会被掩盖，即使是CNS（Cell，Nature，Science）级别的工作。

传统的观点认为核移植是获得个体特异的多能干细胞的主要途径，但该方法技术难度高，成功率低，至今没有获得人的核移植胚胎干细胞。

笔者至今仍记得2007年初（刚进实验室）看到Shinya Yamanaka于2006年发表在Cell上关于iPS的论文时的兴奋心情。

我立刻意识到这项工作的重要性，虽然他们最初的结果并不完美，当时获得的iPS细胞按现在的标准只能算是半成品，因此部分人对这项工作的看法是半信半疑。

直到一年后，Shinya Yamanaka和Rudolf Jaenisch 同时在Nature上报道获得可以生殖系传递的iPS细胞，基本上打消了人们对这个发现的质疑，而随后越来越多的工作进一步证实这个发现。

虽然这两年内他的产出不多（2010年有分量的工作只有一篇PNAS），但仅凭2006年那篇论文已经使他成为诺贝尔奖最热门的候选人。

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项
徐皓;程随涛;张衍国
【期刊名称】《第四军医大学学报》
【年(卷),期】2005(26)B12
【摘要】0引言成纤维细胞是皮肤组织受损后的主要修复细胞．正常情况下，其处于相对静止状态，当皮肤受损或发生某些病变时，成纤维细胞表现为增生活跃和代谢旺盛．近年来，国内已有一些科研单位开展皮肤成纤维细胞的培养技术，以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞，从而为自体皮肤成纤维细胞的基因治疗和相关疾病的研究提供充足、可靠的靶细胞．国内各实验室在进行成纤维细胞原代培养时方法不一，多以组织块法和酶消化法为主．我们通过应用组织块法进行皮肤成纤维细胞原代培养而获得大量稳定细胞，并总结出皮肤成纤维细胞原代培养中组织块方法的注意事项，为今后进行细胞培养起到了一定的指导作用．
【总页数】2页(P74-75)
【作者】徐皓;程随涛;张衍国
【作者单位】武警陕西省总队医院皮肤科,陕西西安710054;武警陕西省总队医院耳鼻喉科,陕西西安710054;第四军医大学唐都医院皮肤科,陕西西安710038【正文语种】中文
【中图分类】R758.24
【相关文献】
1.酶消化组织块盖玻片培养法原代培养人牙周膜细胞 [J], 张丽娟;段春红;郝梅;张娜;王婷
2.人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项 [J], 徐皓;程随涛;张衍国
3.酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞 [J], 丁香莹;蔡劲薇;潘吉铭;梁敏
4.酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞 [J], 丁香莹;蔡劲蔽;潘吉铭;梁敏;
5.胰蛋白酶消化法和组织块法原代培养人包皮成纤维细胞的比较 [J], 王志强;梁锐;陈明清;邓俊;李文亮;陈天星;文政琦;杨军
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人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定

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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见细胞培养第 2 天； c：细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d：细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ）： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养通过酶消化法及贴壁筛选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
王玲玲1 马峰2 张玉成杜珍武张桂珍（吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林长春 130033）
〔摘要〕目的对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果利用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论成功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。

一种皮肤致敏体外替代方法介绍-人细胞系激活试验

一种皮肤致敏体外替代方法介绍-人细胞系激活试验田胜慧;柯军;杨立峰;翁银标;颜林【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2013(023)012【摘要】过敏性皮炎是由过敏原引起的皮肤病,主要是指人体接触到某些过敏原而引起皮肤红肿、发痒、脱皮等皮肤病症.目前,化学物致敏性评价主要依赖于动物实验.近年来,在动物福利和政府监管的推动下,采用体外培养细胞代替动物模型进行化学物致敏性的研究已成为趋势.人细胞系激活试验主要通过检测人THP-1细胞接触化学物后细胞表面标志物以及信号通路的变化判断其是否具有致敏性.该试验方法已被欧美和日本的多个实验室验证其可行性,但目前其临床应用价值还未被完全认可.随着研究的逐步深入,新的标志物和评定方法也在不断被开发和验证.【总页数】4页(P48-51)【作者】田胜慧;柯军;杨立峰;翁银标;颜林【作者单位】广东省医疗器械质量监督检验所,广州510663;广东省医疗器械质量监督检验所,广州510663;广东省医疗器械质量监督检验所,广州510663;广东省医疗器械质量监督检验所,广州510663;广东省医疗器械质量监督检验所,广州510663【正文语种】中文【中图分类】R33【相关文献】1.人嗜碱性粒细胞肿瘤细胞系KU812F检灏牛乳及其替代品致敏性方法的建立 [J], 丛艳君;任发政2.基于荧光定量的人细胞系激发试验评价皮肤致敏性的研究 [J], 陈田;马珅俊;杜军;章瑶3.一种体外皮肤腐蚀性试验替代方法的建立 [J], 罗飞亚;张露勇;邢书霞;王钢力4.直接多肽结合试验组合人细胞系活化试验预测皮肤致敏物的探讨 [J], 柯逸晖;陈彧;程树军;徐嘉婷;谈伟君5.基于树突状细胞激活建立皮肤致敏的体外方法 [J], 陈健;柯逸晖;陈彧;谈伟君;程树军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人羊膜成纤维细胞的分离和鉴定

人羊膜成纤维细胞的分离和鉴定张啸环;段明华;闫玉礼;潘新;李海清;周长龙;赵天倚【摘要】目的:建立人羊膜成纤维细胞的体外培养方法,通过细胞的形态特征和免疫组织化学进行鉴定,从而获得人羊膜成纤维细胞,为后续的干细胞研究奠定基础.方法:从足月分娩人胎盘剥离羊膜,胰蛋白酶和胶原酶消化后分离人羊膜成纤维细胞,采用含表皮生长因子(EGF)的DMEM培养基进行培养.显微镜下观察细胞形态表现,采用HE染色和免疫组织化学染色分析细胞特征,采用流式细胞术(FCM)分析人羊膜成纤维细胞的纯度.结果:采用胰蛋白酶和胶原酶先后消化获得人羊膜成纤维细胞,显微镜下观察,细胞呈放射状或旋涡状生长.免疫组织化学染色,人羊膜成纤维细胞明显表达成纤维细胞标志物波形蛋白(Vimentin),不同程度地表达S100钙结合蛋白A4(S100A4),不表达上皮细胞标志物角蛋白19(CK19).流式细胞术分析,人羊膜成纤维细胞的纯度为86.1％.结论:成功建立了人羊膜成纤维细胞分离和鉴定方法,获得的细胞具有成纤维细胞的特异标志和表型特征.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(044)004【总页数】5页(P845-848,封3)【关键词】人羊膜成纤维细胞;HE染色;免疫组织化学;流式细胞术【作者】张啸环;段明华;闫玉礼;潘新;李海清;周长龙;赵天倚【作者单位】长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107;空军航空大学,吉林长春 130022;空军航空大学,吉林长春 130022;空军航空大学,吉林长春 130022;长春中医药大学药学院中药炮制教研室,吉林长春 130107【正文语种】中文【中图分类】Q813.1人羊膜是一种胎膜，分为人羊膜上皮层细胞[1]和人羊膜间充质基质细胞[2]，其中人羊膜成纤维细胞属于间充质基质细胞。

碱性成纤维细胞生长因子在活性全层皮肤构建中的运用

I 万方数据Leabharlann 汕头大学医学院硕士学位论文
一组织学所见 HE 染色结果显示，气液面培养 2 周时，bFGF 添加组和未添加组的真皮厚度可见明显
差异。3 周、4 周，bFGF 添加组仍保留了较厚的真皮成分。二免疫组化染色 1. 分化型 keratin 的表现
bFGF 非添加组 2 周、3 周，Keratin1 在表皮上层表达，但是第 4 周几乎全部消失；bFGF 添加组 2 周、3 周，Keratin1 也在表皮上层表达，但是与 bFGF 非添加组相比，Keratin1 的表现更接近正常皮肤的表现并持续到 4 周。Keratin10 在 bFGF 非添加组几乎没有表达；而在 bFGF 添加组 2 周、3 周、4 周，Keratin10 主要以棘层为中心表达。 2. 增殖型 keratin 的表现
从手术时废弃的剩余正常皮肤分离出表皮角化细胞和成纤维细胞并体外培养扩增。采用第 4 代表皮角化细胞构建全层活性皮肤（living skin equivalent, LSE），第 5 代真皮成纤维细胞构建活性全层皮肤(LSE)。准备 I 型牛胶原溶液（Sigma 公司，美国) 6 容量，0.1N NaOH1 容量，8 倍浓度 DMEM1 容量，20%FCS/DMEM10 容量，将上述溶液在 4℃进行混合。每个 insert (Transwel-COL, membrane pore size, 3 µm, Costar; Corning 公司，美国)中添加 1ml，于室温静置 10 分钟，使其胶冻化。在 10%FCS/DMEM 培养基中，调制成纤维细胞为 5x105 个/ml。将该细胞悬液 2 容量与上述胶原混合液 8 容量进行混合，每个 insert 缓慢注入 3.5ml 后待其胶冻化，而后添加 10%FCS/DMEM 培养基，于细胞培养箱中静置。5 日后，在收缩凹陷的胶原凝胶上播种表皮角化细胞，液相下培养 2 日待细胞达到融合后，开始气液面培养。在培养基中添加 30ng/ml bFGF（珠海亿胜生物制药有限公司，中国），对照组添加等剂量的无菌注射用水，每 2 日换液一次。在气液面培养后的不同时点（2 周、3 周、4 周）采取 LSE 样本，进行石蜡包埋。制作 6μm 厚石蜡切片，进行 Hematoxylin-eosin(HE)染色和免疫组织化学染色。图像由奥林帕斯 AX80 显微镜耦合奥林帕斯 DP50 数码相机 (Olympus 公司，日本)拍摄获取。采用 image-pro plus 6.0 (ipp)图像分析软件分别测量实验组与对照组的真皮层厚度，统计结果以均数±标准误（ ±S）的形式表示，各周的两组数据之间比较采用 t 检验，P 值<0.05，P 值<0.01 为有显著性差异。结果

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

·基础研究·以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞*杨俊林刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴奔高庭潘盛邬玲仟梁德生夏家辉（中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078）摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。

方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。

将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。

结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。

结论：HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。

关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号：R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts asfeeder cells*YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting,PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui（State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ）ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs.Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009）16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298）作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@ 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@ 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者△通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@ （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30）前言自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。

【内科医学论文】干细胞研发与运用

干细胞研发与运用胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞。

它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。

研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。

成体干细胞主要有造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和神经干细胞。

用于移植的细胞多数来源于外周血、骨髓和脐带血，也有部分来源于骨骼肌和脂肪组织。

虽然胚胎干细胞代表了最原始的全能干细胞，在组织工程和细胞治疗中具有广阔的应用前景，但是它有分化调控机制的复杂性和来源途径的伦理学争议;成体干细胞在成体组织中己经保留了发育过程中出现的完整干细胞谱，为干细胞发育机制研究提供了较为理想的模型，但成体干细胞的分化发育潜能己受到限制。

随着干细胞研究的逐步深入，涌现出一些有别于传统干细胞的新型干细胞，下面就新型干细胞的研究进展做一综述。

1新型干细胞1.1诱导多能干细胞(iPS)2006年日本京都大学Ya-manaka等［1］率先报道了iPS细胞的研究。

他把Oct3/4，Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似［2］。

2007年体细胞转变成“iPS细胞”的成果发表。

Hanna等［3］用来自患病小鼠尾巴的皮肤细胞产生了iPS细胞，然后用健康的基因取代了涉及镰刀形红细胞贫血症的基因，研究人员将它们输给供体小鼠，这些细胞在小鼠身上开始产生健康的血细胞，这些小鼠的疾病症状因此有了改善。

将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞［4］。

2009年，中国科学家利用iPS 细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性［5］。

因干细胞技术和体细胞核移植技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有伦理学的问题。

人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定

人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定作者：马英智张丽红孙梅李玉林【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。

方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。

结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin 15)呈阴性表达。

结论成功建立体外稳定培养hFbs 的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。

【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定【Abstract】Objective To explore a method of the isolation, culture and identification of human fibroblasts (hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded and observed under phase contrast microscope, and they were identified with immunocytochemistry and flow cytometry (anti vimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast microscope, the cells were observed to uniformed population of cells and fibroblast like. Immunocytochemistry and flow cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positivefor vimentin, negative for cytokeratin 15). The cells were sub cultured 6 generations. Conclusions A method for isolating and culturing hFbs in vitro is established successfully.【Key words】Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

中国组织工程研究第17卷第40期 2013–10–01出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 1, 2013 Vol.17, No.40doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.012 []孙加斌，顾翔，潘月晴. 人胚胎成纤维细胞饲养层的制备[J].中国组织工程研究，2013，17(40):7096-7101.P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7096www.CRTER .org孙加斌★，男，1987年生，山东省邹城市人，汉族，扬州大学医学院在读硕士，主要从事心血管疾病基础及临床方面的研究。

********************通讯作者：顾翔，教授，主任医师，博士生导师，江苏省苏北人民医院心血管内科(扬州大学第一临床医学院)，江苏扬州市 225001sbyygx@medmail. 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2013)40-07096-06收稿日期：2013-03-09 修回日期：2013-04-07 (201303011/G ·W)Sun Jia-bin ★, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China ********************Corresponding author: Gu Xiang, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China******************.cnReceived: 2013-03-09 Accepted: 2013-04-07人胚胎成纤维细胞饲养层的制备*★孙加斌1，顾翔1，潘月晴2 (江苏省苏北人民医院，1心内科，2妇产科，江苏省扬州市 225001)文章亮点：1 因为人胚胎成纤维细胞能很好地支持人胚胎干细胞、人胚胎生殖细胞等人干细胞的生长，从而推测人胚胎成纤维细胞亦能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。

干细胞研究的新进展

干细胞研究的新进展：从“定向分化”到“克隆”干细胞研究作为生命科学的重要研究领域，以其实质性的意义和前沿性的技术为人们所关注。

在过去的几十年里，干细胞研究已经取得了重要的进展，包括干细胞的发现、干细胞的培养和定向分化以及干细胞移植治疗等。

近年来，干细胞研究又迎来了一个突破性的进展：干细胞的克隆。

2018年11月25日，中国科学家杨忠民等在国际知名学术期刊《细胞研究》上发表论文，报道了他们成功地从人类成年细胞中克隆出胚胎干细胞。

这一研究成果意味着，科学家们已经突破了干细胞研究中的一个难点问题，为未来的生命科学研究和医学实践提供了更为广阔的前景。

干细胞是一种可以自我更新并具有分化能力的细胞，具有重要的生物学意义和医学应用前景。

干细胞根据其来源和分化潜能的不同可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。

胚胎干细胞来源于受精卵发育过程中的内细胞团，可以在体外无限制地自我更新并分化成体内的各种细胞类型，如神经细胞、心脏细胞、肝脏细胞等。

成体干细胞则可以在成体器官中起到修复和更新细胞的作用，包括造血干细胞、皮肤干细胞等。

然而，干细胞研究并非容易的事情。

其中一个问题就是如何让干细胞在体外定向分化形成特定的细胞类型。

这被称为定向分化。

科学家们利用各种培养条件和信号物质，可以将一部分干细胞分化成心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞等特定类型的细胞，以实现对某些疾病的治疗。

然而，干细胞的定向分化也有一些局限性。

一方面，细胞培养条件和信号物质的优化需要长期反复的试错，学习干细胞定向分化技术需要高超的实验技能和大量的实验操作。

另一方面，有些细胞类型的定向分化非常困难，如心室肌细胞和β细胞等，这就限制了干细胞治疗某些疾病的应用前景。

2018年，中国科学家突破了干细胞定向分化的难题，利用一个全新的技术途径，即核质移植技术，从一种成年细胞中克隆出了胚胎干细胞。

这一技术的核心是将一个成年细胞的核移植到一个已经去除核的卵母细胞中，然后通过一系列复杂的操作，重新激活这个卵母细胞的发育程序，最终得到胚胎干细胞。

人胚胎成纤维细胞作为组织工程皮肤种子细胞的可行性研究

ａｔｎｃｔＴｒｅ— ｍｅｓｏａｋｎｃｓｒｃｓｗｅｅｏｔｉｅｙｓｅｎｕｔｒｄｃｌｎｒｔｔｉｃｌｇｅｃｆｏｄｈｎｉｉｉｇｅｙｈｅｄｉｎｉｎｌｉｏｎｔｔｒｂａｎｄｂｅｄｉｇｃｌｅｅｌｉａａｌｏｌｓｕｕｓａｎｓａｆｌＴｅ
ｃｎｅｌｆＬ６ａｄＴ一，ｎｔｅｄｒｓｃｌｒｇｓｐｒａａｔｓｍｅｓｒｄｂＬＳｔｏ．ＲｓｌＪｍｏｏａｅｏｔｎ一ｎＧＦ１ｉｈｅｍｉｕｔｉｕｅｎｔｎａｕｅｙＥＩＡｍｅｈｄｅｕｔｎｏｆ３ｕｎｗａｓｎｌｒｙ
ｆｏａｓｓｉｂｌｔｂｒ
ＬＵＬｕ１Ｉｕｅ，ｏｉＩｉ１ＬＷ —ｄ ’ ＣＡＩＧｕ —ｂｎ
（．ｅｔｉａｄＰｌｅＴｅｔｎＣｎｅ，ｉｉｎＧｅｅａＨｓｉｌｅｉ００８Ｃｈａ２Ｓａｔｇａｅ１ｆｌｎａａｒａｍｅｔｅｔｒｎＭｅａｎｒｌｏｐｔ，ｉｇ１０２，ｉ；．ｃｒｎｅｒｔｄＣｌｐｔＣｈａｔａＢｊｎｎＩＴｅｔｎＣｎｒ，ｌｓｉＳｒｅｙＨｏｐｔｌｈｎｓｃｄｍｙｏｄｃｌｃｅｃｓＰｋｎｉｎＭｅｉｌｏｌｇ，ｅｉｇｒａｍｅｔｅｔＰａｔｕｇｒｓｉ，ｉｅｅＡａｅｆｅｃａＣＭｅｉａＳｉｎｅ，ｅｉｇＵｎｄｃｌｅＢｉｏａＣｅｊｎ
法：取人流产胚胎皮肤、正常儿童皮肤，同条件下分离培养成纤维细胞，相比较两组细胞镜下、超微结构以及增殖特性，异体淋巴细胞混合实验对比其抗原性。以第三代细胞复合鼠尾胶原构建三维培养，ＬＳＥＡＡ法分别测定两组三维构建培养液中Ｉ一，Ｇ —ＤＬ６ＴＦ含量。结果：与普通成纤维细胞相比，胚胎成纤维细胞扩增后具有更好的细胞形态和功能，生长速度快，分裂指数高，不刺激异几乎体淋巴细胞增殖。鼠尾胶原支架中成纤维细胞生长状态良好，在并且具有一定的组织强度。胎儿成纤维细胞组培养液中的ＴＦＧ一０

将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞

将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞贾伟丽;李默;吴剑宇;王淑艳;陈志国;张愚【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)005【摘要】目的探讨将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞.方法将成人的皮肤成纤维细胞用带有Pax6报告基因和绿色荧光蛋白的慢病毒感染,并经历其病毒载体的抗性基因嘌呤霉素筛选后的细胞作为初始细胞,转入在维持神经干细胞生长发育、分化、保持功能稳定性和可塑性中起非常重要作用的10个基因Sox2、Klf4、c-Myc、Tcf3、Ascl1、Brn2、Neurog2、Foxg1、Hes1和Id1,对经过重新编程表达GFP绿色荧光蛋白的细胞用流式细胞仪进行筛选,并对其进行免疫荧光染色和分化的鉴定.结果转入基因后成功诱导为神经干细胞(iNSCs).iNSCs能表达神经干细胞的标志性基因(Nestin),能分化为神经元(βⅢ-tubulin)和星形胶质细胞(GFAP).结论通过转入外源因子的方式可以将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞.【总页数】4页(P579-582)【作者】贾伟丽;李默;吴剑宇;王淑艳;陈志国;张愚【作者单位】首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053;首都医科大学宣武医院细胞生物室,北京100053;首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室,北京100053【正文语种】中文【中图分类】Q28【相关文献】1.Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞 [J], 刘畅;戎利民;刘斌2.碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养[J], 翟婧妍;段红梅;尚俊奎;杨朝阳;李晓光3.碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化及与肌细胞的共培养[J], 翟婧妍;段红梅;尚俊奎;杨朝阳;李晓光;4.不同方法诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为神经干细胞效率的比较 [J], 纪琼琼;李明华;王培军5.新方法将成纤维细胞直接转化为神经干细胞 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

科学家用皮肤细胞成功仿制胚胎干细胞

科学家用皮肤细胞成功仿制胚胎干细胞
佚名
【期刊名称】《科学中国人》
【年(卷),期】2007(000)007
【摘要】来自美国和日本的3个独立科研小组6月6日报告说，他们成功将实验鼠的普通皮肤细胞制成具备胚胎干细胞功能的细胞。

由于此项技术不涉及破坏人类胚胎等伦理道德问题，因此被认为是干细胞研究领域的一大进展。

胚胎干细胞被誉为“万能细胞”，能分化成构成人体不同组织的细胞。

但获取人体胚胎干细胞要破坏人类胚胎，这一点颇受非议。

科学界一直希望找到一种方法，避开胚胎这一环节，利用体内的普通细胞，进行基因重新编排，使其具备干细胞功能。

上述研究的负责人之一、哈佛干细胞研究所的康拉德·霍切林格说，尽管他们的动物实验在干细胞
领域取得重要进展，但这并不意味着现在就可以放弃人类胚胎干细胞研究。

【总页数】1页(P111)
【正文语种】中文
【中图分类】Q813
【相关文献】
1.浙江大学科学家用胚胎干细胞培养的肌腱细胞修复小白鼠受损肌腱获成功
2.专家用皮肤细胞成功仿制胚胎干细胞
3.德国科学家用人类胚胎干细胞成功育成大脑干
细胞4.美国科学家用基因重组技术将遗传性疾病患者皮肤细胞和骨髓细胞成功培
育成“人造胚胎”干细胞，用于遗传病研究5.中国科学家用单倍体胚胎干细胞成
功培育出半克隆鱼
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【课外阅读】科学家俞君英研究治疗白血病艾滋病的万能细胞

科学家俞君英研究治疗白血病艾滋病的万能细胞近日,参与这项研究的美国威斯康星大学麦迪逊分校研究小组领衔人员、华人女科学家俞君英返回故乡——浙江诸暨,看望阔别12年的父母亲人,并抽出宝贵时间拜会老师校友,介绍科研进展,勉励母校学生。

记者借此机会进行采访,瞥见了干细胞研究领域的一番天地,更见识了女科学家的不凡精神。

俞君英:1974年生于诸暨市阮市镇檀溪村一个普通农家,曾就读于朱家站初中、湄池中学,1997年从北京大学毕业后赴美留学,并获得博士学位,2003年起在美国威斯康星大学麦迪逊分校汤姆森实验室工作,开始干细胞研究。

2007年11月20日,她与人合作在世界顶尖学术刊物《科学》杂志上发表论文,宣布成功把人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的新型"万能细胞"。

这项研究被称为是一项里程碑式的重大突破,为干细胞研究在医学领域的广泛应用开辟了道路。

胚胎干细胞:胚胎干细胞被称为"万能细胞",它可以分化出皮肤细胞等各种组织细胞。

但人类胚胎干细胞研究存在巨大的伦理争议,在很多国家也被法律禁止。

而且从科研角度来看,涉及人类胚胎干细胞的克隆技术操作难度非常大,卵子的来源也是个问题。

相比之下,利用基因技术"仿制"胚胎干细胞,技术操作上相对容易,成本也会低得多。

做科学研究要有平常心"我觉得得不得奖并不重要,关键是能造福他人。

"当记者祝贺俞君英的科研成就时,她回答得很朴实。

她说,当这一成果发表时,全球多家权威媒体报道,称此项研究有可能得诺贝尔奖,对此,她当时就以很平常的态度来对待。

俞君英介绍,她现在依旧在实验室专门研究"万能细胞"的实际应用。

"其实,做科学真的很辛苦,除了要有智力、毅力、耐力和一定的承受能力,最重要的是要有一颗平常心。

因为,就科学实验而言,过程远比结果重要,科学实验总是面临着这样的境地:不断实验,不断失败,不断重复,许多时候,失败的几率在99%以上,成功的几率在1%以下。

成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的研究的开题报告

成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的研究的开题报告摘要:本文介绍了成年皮肤成纤维细胞克隆绵羊的研究，研究设计包括采集成年皮肤细胞，进行体外培养，建立成纤维细胞克隆细胞库，筛选合适的细胞进行克隆，进一步对其进行鉴定及功能研究等。

本文的研究旨在为相关领域提供实用的方法及技术，促进科研进展和产业发展。

关键词：皮肤成纤维细胞，克隆，细胞库，分子鉴定，功能研究1. 研究背景和意义人类皮肤被构成了一个多细胞的复合器官，包括上皮、真皮和皮下组织。

其中皮下组织含有丰富的成纤维细胞，为皮肤组织提供生物力学支撑、细胞信号调控及外界环境反应等多种功能。

然而，在人类皮肤组织中难以准确检测功能性成纤维细胞，这一限制制约了对其生物学特性的认知及其可应用性的研究。

通过体外培养后的成纤维细胞，是目前应用最为广泛的研究模型。

但由于患者年龄、身体部位以及培养条件等多种因素的影响，成纤维细胞的功能及其代谢水平在体外培养中会出现浮动性，使其代表性和稳定性降低，特别是在慢性疾病研究方面的应用变得更为困难。

为了解决这一问题，研究者设计了建立成纤维细胞克隆库的方案。

本文的研究旨在建立成年皮肤成纤维细胞克隆库，对其中控制细胞的鉴定和功能进行深入的研究，为相关领域的基础及应用研究提供实用的方法及技术。

2. 研究设计2.1 成纤维细胞的采集和体外培养从成年皮肤中采集约50mg的皮肤组织样本，先剪成细小颗粒后再进行消化处理。

然后，分离出组织细胞，并进行体外培养。

培养基的具体配方和培养条件参照相关文献。

待细胞生长至足够数量后，收集细胞并冻存备用。

2.2 成纤维细胞克隆细胞库的建立采用限制稀释法在96孔板中进行成纤维细胞单细胞克隆。

将单细胞转移到96孔培养板中，培养成非常微小的细胞集群，确认其为同样的细胞类型后移至24孔带孔板进行扩增培养。

为了避免细胞集群内的细胞杂交而产生异种克隆，需要进行一些筛选和检验，确保克隆的单一性和纯度。

2.3 克隆细胞的筛选和鉴定采用RT-PCR和Western blot等方法对克隆的细胞进行分子鉴定，确认其为成纤维细胞，并确定其基因表达和蛋白水平等特征。

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方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。

将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。

结论：HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。

hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。

目前大多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的，MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。

而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。

早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病毒都有严重的传染性甚至致死的。

另外有研究报道，培养在MEF上的hESCs细胞表面可检测到一种鼠的唾液酸分子Neu5Gc[3]，它在人体内会引发严重的免疫反应。

为了减少动物源性病原体的污染及弥补MEF饲养层增殖能力差的缺陷，建立一个以人源细胞为滋养层的hESCs培养体系显得尤为重要。

本研究采用组织贴壁法从人皮肤中分离出人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs），并以HDFs作为饲养层与hESCs共培养，建立了一个以HDFs作为饲养层的能较好支持hESCs未分化生长的人源培养体系，使hESCs向临床应用推进一步，同时也为IPS细胞（induced pluripotent stem cells）的人源培养奠定基础。

1材料与方法1.1材料1.1.1人胚胎干细胞系、皮肤组织和实验动物美国加州大学hESCs细胞系HSF6（美国国立卫生研究院干细胞银行注册号为UC06）；皮肤组织来自中南大学湘雅医院外科手术病人，分别取自胸部、腹部、喉部、颈部，皮肤面积约0.5到2.0cm2不等。

所有皮肤组织的采集在病人的知情同意下进行；用于制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的ICR孕鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2主要试剂Knockout DMEM培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、血清替代物(Knockout serum replacement)、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、双抗、人碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)、分散酶(Dispase)、Ⅳ型胶原酶(Collagenase TypelV)、Trizol试剂和胰酶均购自Invitrogene公司；丝裂霉素C、明胶(Gelatin)购自Sigma公司；碱性磷酸酶(Alkaline phosophotase，AKP)检测试剂盒、胚胎干细胞鉴定试剂盒(ES Cell Characterization Kit)购自Chemicon公司；反转录试剂盒购自Promega公司。

1.2方法1.2.1人皮肤成纤维细胞（HDFs）的分离与培养皮肤组织用含双抗的PBS冲洗后，去除脂肪组织和角质层，剪碎成1mm3大小，去除组织块周围的PBS，将其转至25cm2培养瓶，均匀分布于瓶底，翻转瓶子，加5ml培养基，置于37℃、5%CO2培养箱，待组织块贴壁8-12小时后，再翻转培养瓶使组织块没于培养基中，37℃、5%CO2培养箱培养7-14天左右，每3-4天换液一次。

待HDFs长至80%-90%左右汇合度时，用PBS洗两次，加入适量0.25%胰酶，37℃消化2-3分钟，用完全培养基终止消化，200g离心5分钟，去上清，以1：2比例传代。

1.2.2小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的分离与培养断颈处死妊娠13.5天的ICR孕鼠，无菌条件下取出整个子宫，将子宫置于含有双抗的PBS中洗涤数次，除去血迹转移到新的培养皿内操作。

无菌眼科剪沿子宫系膜侧剪开子宫，用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用灭菌含有双抗的PBS洗涤胎鼠数次。

用眼科剪去除胎鼠的头部和内脏，再用无菌刀片于无菌培养皿内将胎鼠切成1mm3左右的碎块，加入5ml0.25%胰酶，用10ml吸管上下吸吹5-6次，37℃、5%CO2培养箱中放置5分钟，再补加5ml0.25%胰酶，吸吹均匀，重新放回37℃培养箱中消化，总消化不超过20分钟。