抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法

抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法09级生科3班余振洋200900140156一、【实验原理】1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物：恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。

多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。

寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。

世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。

8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。

即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。

这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。

鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。

这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。

2．关于筛选方法：下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。

1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。

已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。

因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。

2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。

或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。

现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA水解释放出具有强烈荧光的荧光素。

死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。

3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物结晶紫染色测定法是由Gillies等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。

其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。

而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。

近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。

4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨。

有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。

有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。

5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。

近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。

经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。

在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。

二、【试验方法】1. 以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物——端粒重复扩增法1）端粒酶产物的扩增取细胞酶提取液1 L分别加人TS引物0．36p,mol／L，dNTP501xmol，TaqDNA 多聚酶1 IU，CX引物0．28Ixmol／L，Mg¨ 1．5 mmol，在251xL反应液中进行PCR 扩增。

扩增程序为在3O℃反应30 min，72~C30 S，然后在94℃变性30 S，55℃退火30s，72℃延伸30 S，进行3O个循环。

2）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物用12％丙烯酰胺灌胶，胶聚合后，取扩增产物1025微升加人加样孔，以180V 的电压进行电泳2h左右。

3）银染显色用1O％乙醇和0．5％冰醋酸固定聚丙烯凝胶35 min，然后加人硝酸银溶液(最终浓度为0．2％)，在37℃水浴上振荡染5 min，用超纯水洗涤三次。

再加人显色液(30％的NaOH和0．1％的甲醛)振荡直至DNA条带出现，一般为20 min。

最后将显色凝胶移至固定液中固定5 min。

普通光源照像。

4）结果判断由于端粒是由短DNA重复序列组成，而端粒酶的作用是维持端粒末端的长度，因此可以用PCR扩增产物间接反映端粒酶活性。

即在DNA条带中显示出6bp的梯状条带，则判断端粒酶的活性依然存在为阳性。

恶性肿瘤治疗的理想靶点应该是寻找到一种对肿瘤细胞生长所必须，但又不存在于正常细胞的物质。

端粒酶就是一种在许多肿瘤组织中处于高表达活性，而在正常组织中却没有酶活性表达的特殊核糖核蛋白物质(除生殖和造血干细胞外)。

它在维持肿瘤细胞的高度增殖时，对端粒的缩短起着重要的作用，从而提示端粒酶可能是恶性肿瘤组织的一个标志。

2．应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物1）细胞培养该实验采用体外培养的不同种肿瘤细胞系，经0．25％胰酶加0．02％ EDTA 消化后吹打，600—800rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 +／mE。

每组3—4个平行孔，接种在微孔培养板中，对照组只加细胞不加药物。

37℃5％CO，条件下培养。

2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药，使药液终浓度为0．1ug／mL，0．5ug ／mL，1ug／mL，5ug／mL，10ug／mL，放人培养箱中培养至最佳作用时间。

3）荧光素测定培养至最佳作用时间的细胞移去培养液，用PBS缓冲液冲洗两遍，准确加入1．8mlM~LPBS缓冲液，随后加入200ulM~L含FDA的DMSO储备液(100ug／mL)，使其终浓度为10ug／mL，摇匀后，37~C5％CO 条件下培养1h，用荧光分光光度仪RF 一540在激发光波长为485nm，发散光波长为538nm，狭缝为2nm，衰减为5(×16)的条件下测定每孔溶液的荧光强度值。

荧光素测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，其细胞测定范围宽、线性好，适用于大量抗肿瘤药物的筛选和临床抗肿瘤药物的预试。

3．应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物——结晶紫染色法1）细胞培养实验采用体外培养细胞系，经0．25％胰酶加0．02％EDTA消化后吹打，600—800 rpm离心，稀释至细胞浓度为5×10 爪／mL。

每组4个平行孔，接种在微孔培养板上。

空白孔只加营养液不加细胞，对照孔只加细胞不加药物。

37℃ 5％CO 条件下培养。

2）药物敏感性实验常规传代细胞待贴壁后，每孔加药液，使药液终浓度为0．1 g／mL，0．5 ／mL，1 g／mL，5 g／mL，10 ／mL等。

放人培养箱培养至最佳作用时间。

3）结晶紫染色测定至最佳作用时间的细胞用11％的戊二醛固定，摇20min，使细胞停止生长，达到实验结果的均一性。

固定后的细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。

37~C烘干。

加入0．1％的结晶紫液对细胞染色。

振摇30min，用蒸馏水洗涤，至剩余的结晶紫液冲洗干净。

37~C烘干。

加入10％的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取，1 h后在波长为595nm处测定。

结晶紫染色测定法具有快速、灵敏、准确性高、重现性好的特点，是一种较好的抗肿瘤药物的筛选方法。

4．应用噬菌体筛选抗肿瘤药物——双层琼脂平板～纸片法1)用pH7．4之2％固体琼脂倾注于平皿底部，厚为2mm，凝固后待用。

2)取100ml pH7．4之0．7％半固体营养琼脂，溶化后冷却至50~C，加入培养18h 并已稀释l0 之金色葡萄球菌75培养液4mL及培养18h未稀释之金色葡萄球菌47培养液4mL，混匀后，倾人平板上层，厚约1mm。

3)上层琼脂凝固后，用6mm直径之无菌圆形滤纸片1片，沾取待筛药物浸膏贴于平板上，另以争光霉素为阳性对照，于37℃中培养。

4)24h后观察结果，阳性结果：溶原性细菌释放多量成熟的嗜菌体，侵入指示菌体内繁殖，而使指示菌裂解，在滤纸片周围出现密集之噬斑。

阴性结果：滤纸片周围与背景相同。

通过实验证明，具有诱导噬菌体作用的药物大多具有抗肿瘤作用，且用噬菌体一细菌间特性建立的筛选模型具有简便、迅速、适宜大量药品筛选的特点，可以广泛应用于抗肿瘤药物的筛选。

5．1细胞水平的筛选1)MTT法。

细胞培养：肿瘤细胞用含10％热灭活的小牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5％CO2及饱和湿度下培养。

药物处理：将中药单体或提取物分别溶于DMSO，作用于培养细胞体系。

药物浓度在0．005至0．5(mg／mL)之间，等量DMSO作为阴性对照。

培养体系中溶剂浓度不超过l％。

培养24h后，显微镜下观察细胞状态。

体外药物敏感性分析：针对药物单体，以几种肿瘤细胞系为实验模型，以MTT实验法分析其体外抗肿瘤活性。