DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度

dns葡萄糖标准曲线制作方法

dns葡萄糖标准曲线制作方法制作DNS（Dinitrosalicylic Acid）葡萄糖标准曲线是在生物化学和分子生物学实验中常用的方法。

这个标准曲线可以用来测量葡萄糖浓度，并通过与待测溶液的比较来确定葡萄糖的含量。

以下是制作DNS葡萄糖标准曲线的步骤：1. 准备材料：- 葡萄糖标准溶液（不同浓度，如0.1M，0.05M，0.01M等）- DNS试剂（Dinitrosalicylic Acid）- 蒸馏水- 1.5 mL离心管或其他合适的反应容器- 移液管或吸管2. 首先，准备一系列葡萄糖标准溶液。

可以从高浓度到低浓度依次准备各种浓度的葡萄糖溶液，以用于标准曲线的绘制。

3. 取1.5 mL离心管或其他合适的容器，分别加入相应的葡萄糖标准溶液，每个容器中的溶液体积相同。

注意，每个容器中只加入葡萄糖标准溶液，不加入DNS试剂。

4. 后续，加入相同体积的DNS试剂。

每个容器中的葡萄糖标准溶液和DNS试剂的体积比例应一致。

5. 将所有样品置于沸水中煮沸，通常持续煮沸5-10分钟。

6. 煮沸后的样品冷却至室温。

7. 使用分光光度计根据DNS试剂吸光度与葡萄糖浓度之间的关系测量每个样品的吸光度。

8. 将各个葡萄糖标准溶液的吸光度值绘制成曲线图。

通常，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为吸光度。

可以使用Excel等软件进行绘图和线性回归分析，以获得最佳拟合直线。

9. 根据绘制出的标准曲线，可以通过测量待测溶液的吸光度值，并利用标准曲线确定其葡萄糖浓度。

制作DNS葡萄糖标准曲线的方法简单且可重复，可以方便地应用于各种实验中测量葡萄糖浓度的需求。

通过标准曲线的绘制和分析，我们可以准确地测量和确定不同样品中葡萄糖的含量，从而为进一步的生物化学和分子生物学实验提供可靠的数据基础。

标准葡萄糖DNS比色法测定.doc

标准准葡萄糖DNS比色法测定的方法采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定水解液中还原糖含量，用752型分光光度计进行比色测定。

1葡萄糖DNS比色法的测定原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被的还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

2测试药品（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3测试方法（1）葡萄糖标准曲线制作①按下表制备9个试管。

②向9支试管中分别加入DNS试剂0.5ml，充分混合。

③将9支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。

④将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。

⑤向各管中分别加入4mL蒸馏水，充分混合。

⑥以空白（1＃）管做对照，用分光光度计于540nm波长下分别测定各管溶液的OD值。

⑦以每管在540nm下的吸光值为纵坐标，每管所含的葡萄糖浓度为横坐标作图，即可得到一条通过零点的直线。

如果直线不通过零点则需重做。

标准葡萄糖曲线浓度的量取Tab.2.2 Preparation on standard curve of glucose试管编号标准葡萄糖溶液(mL) 蒸馏水(mL) 最终浓度(mg/mL)1 0 0.5 02 0.05 0.45 0.13 0.1 0.4 0.24 0.15 0.35 0.35 0.2 0.3 0.46 0.25 0.25 0.57 0.3 0.2 0.68 0.35 0.15 0.7 90.40.10.8（2）测定步骤①样品稀释。

②取2支试管，其中一支做对照，向样品试管中加入稀释后的样品溶液0.5mL ，空白不加。

③向两支试管中分别加入DNS 试剂0.5ml ，于沸水浴中加热5min ，然后冷却。

DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究

分析检测食品工业科技V ol .29,N o .02,20082008年第02期285　DNS 法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究韩德权,章佳佳(黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080)摘　要:普鲁兰是由出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans )发酵生产的胞外多糖,普鲁兰多糖含量多少是判断发酵成功与否的标志,而多糖含量的准确测定对发酵的过程控制特别重要。

本文研究了DNS 法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的应用,同时研究了色素和不同比例乙醇对DNS 法测定出芽短梗霉发酵液中残糖和总糖的影响。

结论为色素对总糖的测定有干扰,对上清液中的残糖的测定没有影响;不同比例乙醇对DNS 法测定糖含量没有影响。

关键词:出芽短梗霉,普鲁兰,DNS 法App licati on of DNS method t o the determ inati on of saccharide content in Pullulan fermentati on br othHAN D e -quan,ZHANG J i a -ji a(College of L ife Sciences,Heil ongjiang University,Harbin 150080,China )Ab s trac t:The Pu ll u l a n is e xop o l ys a c c ha rid e s (EPS )p rod uc e d b y fe r m e n ta ti on of A u re ob a s id ium p u llu la ns 1The c on te n t of Pu llu la ns is a n ind i c a tion tha t the fe r m e n ta ti on is s uc c e s s fu l o r no t 1The a c c u ra te d e te r m ina tion of the Po lys a c c ha rid e c on te n t i s ve ry i m p o rta n t to the p roc e s s c on tro l of fe r m e n ta ti on 1Th is p ap e r s tud ie s the ap p lic a tion of the DNS m e thod i n d e te r m in ing s a c c ha rid e c on te n t in Pu llu la n fe r m e n ta ti on b ro th a nd the e ffe c t of p igm e n t a nd e tha no l in d iffe re n t ra tio on d e te r m i n i ng re s id ua l s a c c ha rid e a nd to ta l s a c c ha ri d e in the A u re ob a s i d ium p u llu la ns fe r m e n ta tion b ro th w ith DNS m e thod 1The c onc lus i on w a s tha t the p i gm e n t i n te rfe re s the d e te r m ina ti on of to ta l s a c c ha rid e,b u t ha d e ffe c t on the d e te r m i na ti on of there s i d ua l s a c c ha ri d ein the s up e rna ta n t,a ndthed e te r m ina tion of s a c c ha ri d e c on te n t w ith the DNS m e thod w ill no t b e a ffe c te d b y e tha no l in d iffe re n t ra tio 1Key wo rd s:A u re ob a s id ium p u llu la ns;Pu llu la n;DNS m e thod中图分类号:TS20112+3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2008)02-0285-03收稿日期:2007-07-23作者简介:韩德权(1960-),男,高级工程师,硕士,研究方向:生物制药、保健食品材料。

DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。

选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。

目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。

2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。

单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。

目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。

根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。

DNS法测定D-氨基葡萄糖含量方法的研究

DNS法测定D-氨基葡萄糖含量方法的研究刘玥;刘晓兰;周利敏;郑喜群【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2014(000)010【摘要】建立了DNS法测定调味品中色素D-氨基葡萄糖含量的方法。

研究了反应的测定波长、DNS试剂用量、反应时间、反应温度、反应液体积以及反应产物在5h 内的显色稳定性对测定结果的影响。

结果表明：DNS法测定D-氨基葡萄糖含量的最适波长为520 nm，D-氨基葡萄糖浓度在100～300μg／mL时，DNS 试剂用量为1．0 mL，沸水浴反应8 min，反应液体积4 mL，反应产物在5 h内显色性质稳定，该方法精密度良好，RSD为0．08％，回收率为98．86％。

【总页数】5页(P89-93)【作者】刘玥;刘晓兰;周利敏;郑喜群【作者单位】齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006; 农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006; 农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006; 农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006; 农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006【正文语种】中文【中图分类】TS245.4【相关文献】1.HPLC示差折光分析法测定D-氨基葡萄糖盐酸盐中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖 [J], 王英锋;晏利芝;郭雪清2.滴定分析法和分光光度法测定保健食品中D-氨基葡萄糖盐酸盐含量 [J], 骆治琼3.紫外可见分光光度法测定胶囊剂中D-氨基葡萄糖盐酸盐的含量 [J], 刘士团;张芳;刘春霖4.高效液相色谱法测定2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷含量及其稳定性的研究 [J], 王玉洁;张莉5.滴定分析法和分光光度法测定保健食品中D-氨基葡萄糖盐酸盐含量的研究 [J], 陈金东;李蔚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种测定葡萄糖的方法

一种测定葡萄糖的方法在烷基糖苷合成过程中，应用DNS为显色剂的分光光度法对烷基糖苷合成过程中葡萄糖的分析测定进行了研究。

研究结果表明：采用玻璃比色皿，在最大吸光度为510nm波长，葡萄糖浓度范围为1.6-40.9μg·mL-1，吸光度与葡萄糖浓度满足线性关系具有良好的线性关系，吸光度与葡萄糖浓度标准曲线为A=0.0109c,摩尔吸光系数为1962 mol-1·L·cm-1，相关系数为0.9992，回收率在97%-103%之间，显色体系中含有脂肪醇及烷基糖苷对体系吸光度没有影响。

DNS 显色分光光度法用于烷基糖苷水解体系还原糖含量的测定可行，该方法方便快捷、准确度高。

化学分析法是应用葡萄糖分子结构中含有醛基的特点进行分析测定，一般是采用裴林试剂测还原糖的方法，葡萄糖具有还原性，可用还原糖法的测定方法测定，但是还原糖法特异性较差，如果样品中混有其他还原糖可使结果偏高。

优点是方法简单、实用，缺点是通常适用于高浓度系统，但是体系中混有溶剂时，此方法观察终点不明显。

分光光度法测定葡萄糖分为蒽酮显色法和DNS显色法，但是由于蒽酮显色法实在酸性体系中显色，而酸性体系烷基糖苷存在水解副反应的发生，影响测定结果，也不能用于烷基糖苷合成体系中的葡萄糖测定[5,6]。

而分光光度法中采用DNS显色法在碱性体系中显色，烷基糖苷在碱性体系中稳定，是合适的分析测定方法。

为了获得控制萄糖直接与高碳脂肪醇进行缩合反应生成烷基糖苷反应过程中葡萄糖的浓度，采用斐林试剂滴定，由于由N-甲基吡咯烷酮的存在，测定突变点无法确定。

探讨了显色剂用量、显色时间、显色体系碱浓度对吸光度的影响，考察了测定系统中脂肪醇、烷基糖苷存在对测定经过的干扰情况。

为改善萄糖与高碳脂肪醇进行缩合反应过程，提高合成烷基糖苷反应过程的速度、进一步提高烷基糖苷产品的质量，也为研发葡萄糖颗粒与脂肪醇的新工艺技术提供分析测定的可靠方葡萄糖具有醛基，具有还原性，碱性条件下可将3，5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，而3-氨基-5-硝基水杨酸在碱性条件下成橘红色，在一定的实验条件下具有最大吸收，并且在一定葡萄糖浓度范围内与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，本质为3-氨基-5-硝基水杨酸浓度与其最大吸收波长下的吸光度成线性关系，通过吸光度与3-氨基-5-硝基水杨酸浓度线性关系以及葡萄糖浓度与产物3-氨基-5-硝基水杨酸浓度反应关系的线性建立联系，从而以葡萄糖浓度和吸光度做标准曲线，通过测定样品吸光度对应算出样品中葡萄糖浓度，此外，配方中其他成分主要是去除试剂中的游离氧和增强并稳定显色效果[13]。

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度一、实验原理在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm 波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶 2.试剂： 1）葡萄糖 2）2mol/LNaOH溶液 3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22） 4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11） 5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04） 6）蒸馏水 7）DNS 8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到 500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚 5g和无水亚硫酸钠 5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。

贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。

精确称取干燥后的葡萄糖 0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。

分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L 。

三、实验步骤1. 标准曲线制作分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。

用冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶液的A550值。

以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程。

DNS法测定发酵液中总糖含量

DNS法测定发酵液中总糖含量3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。

DNS试剂的配方（3，5-二硝基水杨酸试剂）：称取酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH 2.1g（先配成溶液），苯酚0.5g，无水亚硫酸钠0.5 g, 搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存。

0.1％葡萄糖标准液：准确称取100 mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100 ml，冰箱保存备用。

注意事项：1. 在配制的过程中，如果操作不合理，会出现溶液变黑，或者有鸡蛋花一样的絮状沉淀出现。

2.称取DNS（具体重量，按照你的配方来，下同），加水溶解，水浴45℃；3.逐步加入氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；（a.药品中的氢氧化钠要配制成溶液；直接加颗粒，可能产生鸡蛋花；b.加入氢氧化钠溶液时，溶液的温度会上升，所以要慢慢加，不停地搅拌，同时溶液的温度不能超过48度；温度高了，溶液颜色变黑。

）4. 逐步加入四水酒石酸钾钠、苯酚和无水亚硫酸钠；（顺序最好不要更改！）5.继续45度水浴，同时补水，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；（一定要有耐心地搅拌！）6. 停止加热，冷却至室温，用水定容。

7. 储存在棕色瓶中，避光保存。

室温下存放7天后使用。

有效期为6个月。

（时间不忙的话，最好按照时间来操作，时间紧迫了，时间提前个几天，推后几天，也可以用的）【操作方法】一、葡萄糖标准曲线的绘制取9支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。

以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。

应用DNS测定总糖量的原理

应用DNS测定总糖量的原理引言在食品和饮料行业中，测定总糖量是非常重要的一项指标。

传统的测定方法需要耗费大量时间和资源，而且繁琐的操作容易导致误差。

然而，近年来，应用DNS（葡萄糖酸酯酶-脱氧葡萄糖酸钠）测定总糖量的方法为我们提供了一种快速、准确和高效的测定手段。

DNS测定总糖量的原理DNS测定总糖量的原理是基于酶法，即利用葡萄糖酸酯酶对葡萄糖进行催化作用。

具体的步骤如下：1.提取样品：首先，我们需要将待测样品中的总糖提取出来。

这可以通过一系列的化学提取步骤来实现，例如使用乙醇沉淀或酸水解等。

2.酶催化：在提取得到的样品中，加入葡萄糖酸酯酶，该酶可以催化葡萄糖分子的水解反应，生成葡萄糖和葡萄糖酸。

3.反应终止：加入硼酸溶液对反应进行终止，以防止酶继续催化反应。

4.DNS试剂：在终止的反应液中，加入DNS试剂。

DNS试剂中含有具有吸收特性的重氮化合物，可以与葡萄糖酸反应，生成具有明显吸收峰的化合物。

5.光度测定：将反应液进行离心以去除沉淀，得到清晰的上清液。

使用分光光度计测定上清液的吸光度值，并与标准曲线进行对比，从而得到样品中的总糖量。

优势和应用相比传统的测定方法，应用DNS测定总糖量具有以下优势：•快速准确：DNS法只需几个简单的步骤就可以测定样品中的总糖量，省时省力。

同时，DNS试剂对反应物有很好的选择性，可以准确测定总糖。

•高效便捷： DNS法不需要复杂的仪器设备，只需要普通的实验室设备即可完成测定。

因此，它是一种高效便捷的总糖测定方法。

•广泛应用： DNS法广泛应用于食品、饮料、生物医药等领域。

对于食品行业来说，监测产品的总糖量有助于确保产品质量和安全性。

结论应用DNS测定总糖量的原理基于酶法，通过葡萄糖酸酯酶催化反应和DNS试剂的配合，可以快速、准确地测定样品中的总糖量。

这种方法具有快速准确、高效便捷和广泛应用的优势，对于食品和饮料行业来说是一种非常实用的测定手段。

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DNS法测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。

选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。

目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
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530nm比色。

2、酶活测定方法：
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考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。

单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
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测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。

目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。

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根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。

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DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案
目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。

选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。

目前实验室采用测酶活方法：
1、葡萄糖标准曲线制作：
530nm比色。

2、酶活测定方法：
考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。

单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000
1
)/(⨯⨯⨯=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug.
以下是近期所做的实验结果：
葡萄糖标准曲线
两种产纤维素酶细菌不同测试结果
测定结果
实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。

目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。

根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。

应用不同方法测定发酵液中的糖含量

总糖还原糖含量中图分类号o65216不同显色时间总糖的含量在测定总糖的过程中改变反应时间即显色时间分别为不同波长下葡萄糖曲线的回归方程和相关系数比较tab4comparisonregressionequationscorrelationcoefficientsglucosecurvesunderdifferentwavelengths测定波长葡萄糖曲线的回归方程相关系数准确量取费林试液甲乙液各250ml锥形瓶加入10ml蒸馏水及ml被还原的总糖样品稀释液484y13816x09986再用糖滴定管加入比预备滴定少05ml葡萄糖溶液520y14416x045509997摇匀加热至沸保持微沸滴次甲基蓝溶液在540y13786x052709975沸腾状态下以每两秒一滴的速度加入葡萄糖液至蓝色刚570y12463x036209991好消失为终点
0.5
1
0.359
1
1
0.364
1.5
1
0.372
2
1
0.385
2.5
1
0.377
3
1
0.378
从表 3 看出，在测定发酵液总糖含量时，当 DNS 添加量大于 1.5 mL 时，对结果的影响虽然不大，但浪费大，当小于 1.5 mL 时，还原糖过量，使得测定结果偏低，所以应选择 DNS 添加量为 1.5 mL。
5
1
1
1
1.5
6
1.2
0.8
1.2
1.5
7
1.4
0.6
1.4
1.5
8
1.6
1.4
1.6
1.5
2.1.2 发酵液中总糖的水解
取发酵液 0.5 mL 置于 50 mL 容量瓶中，加 6 mol/L 的盐酸溶液 2 mL，在沸水浴中加热 15 min 水解，冷水冷却后加 6 mol/L 氢氧化钠溶液 1.8 mL，并定容至 50 mL[3]，得总糖水解液。 2.1.3 发酵液中总糖的测定

DNS法测还原糖和总糖

DNS法测还原糖和总糖一、配制试剂1.1mg/mL葡萄糖标准液预先将分析纯葡萄糖置于80℃烘箱内约12小时，至恒重。

准确称取500mg葡萄糖置于烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到500mL容量瓶中，用蒸馏水定容至500mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

2.3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml 2mol/L氢氧化钠溶液中(注意:在加入氢氧化钠过程中, 不适宜用高温促溶，溶液温度不要超过48℃)，接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。

再加入5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000ml。

储存在棕色瓶中，避光暗处保存备用。

（室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月）二、绘制标准曲线将1mg/mL葡萄糖标准液制成浓度为0.5g/L的葡萄糖标准液，分别取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，补水至1mL，加入DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm处测定吸光值，浓度—吸光值作标准曲线，用1.0mL蒸馏水做空白对照。

三、还原糖测定取稀释到适当浓度的发酵液1.0mL，加入DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm 处测定吸光值。

用蒸馏水代替稀释后的发酵液做空白对照。

根据标准曲线计算出还原糖浓度。

四、总糖测定取稀释到适当浓度的发酵液1.0mL，加入6mol/L HCL溶液0.75mL，沸水浴20分钟，冷却至室温，加入6 mol/L NaOH溶液1.0mL，DNS 1.5 mL，沸水浴显色5分钟，冷却后补水至10 mL，550nm处测定吸光值。

用蒸馏水代替稀释后的发酵液做空白对照。

根据标准曲线计算出总糖浓度。

五、原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，将3，5－二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。

DNS法测还原糖

1、分析试剂
DNS显色剂每1000mlDNS溶液含有酒石酸钾钠182g，无水亚硫酸钠3g，氢氧化钠20g，3，5－二硝基水杨酸6.3g，重蒸馏酚4g。

配后过滤放置半月后使用。

1%葡萄糖标准溶液：准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用.
10%ZnSO4溶液.
2、器材
分光光度计，定糖管，移液管，容量瓶，烧杯，电炉等。

[方法步骤]
（一）葡萄糖标准曲线的绘制
取9只定糖管（有盖子，且用绳子系住），分别按照下表1的顺序加入各种试剂，沸水浴中加热5min，后立即流动水冷却。

管内溶液混匀，用空白管溶液调零点，520nm测定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。

表1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量
样品液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。

从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。

求出样品中糖含量。

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度一、实验原理在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶2.试剂：1）葡萄糖2）2mol/LNaOH溶液3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22）4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11）5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04）6）蒸馏水7）DNS8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚5g和无水亚硫酸钠5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。

贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。

精确称取干燥后的葡萄糖0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。

分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L。

三、实验步骤1.标准曲线制作分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。

用冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶液的A550值。

以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标2.发酵液中还原糖的测定1）发酵液过滤或离心得到上清液。

标准葡萄糖DNS比色法测定.doc

标准准葡萄糖DNS比色法测定的方法采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定水解液中还原糖含量，用752型分光光度计进行比色测定。

1葡萄糖DNS比色法的测定原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被的还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

2测试药品（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3测试方法（1）葡萄糖标准曲线制作①按下表制备9个试管。

②向9支试管中分别加入DNS试剂0.5ml，充分混合。

③将9支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。

④将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。

⑤向各管中分别加入4mL蒸馏水，充分混合。

⑥以空白（1＃）管做对照，用分光光度计于540nm波长下分别测定各管溶液的OD值。

⑦以每管在540nm下的吸光值为纵坐标，每管所含的葡萄糖浓度为横坐标作图，即可得到一条通过零点的直线。

如果直线不通过零点则需重做。

标准葡萄糖曲线浓度的量取Tab.2.2 Preparation on standard curve of glucose试管编号标准葡萄糖溶液(mL) 蒸馏水(mL) 最终浓度(mg/mL)1 0 0.5 02 0.05 0.45 0.13 0.1 0.4 0.24 0.15 0.35 0.35 0.2 0.3 0.46 0.25 0.25 0.57 0.3 0.2 0.68 0.35 0.15 0.7 90.40.10.8（2）测定步骤①样品稀释。

②取2支试管，其中一支做对照，向样品试管中加入稀释后的样品溶液0.5mL ，空白不加。

③向两支试管中分别加入DNS 试剂0.5ml ，于沸水浴中加热5min ，然后冷却。

酶活DNS法测定

酶活DNS法测定一、将初筛的菌株接入100mL 种子培养基(250ml 三角瓶) 中, 25 ℃150r ·min - 1 培养24h（此步骤在初筛期省略）,取培养至对数生长期的种子液3mL 接入60mL 发酵培养基(250mL规格三角瓶)中发酵培养。

在30℃,150r ·min - 1 转速下培养144h ,8000r ·min - 14 ℃离心10min ,取上清用DNS 法测酶活。

二、标准曲线的制作精确称取100 ℃干燥至恒重的葡萄糖0. 10g ,加蒸馏水溶解并定容至100mL ,配成1.00mg ·mL - 1浓度的溶液,（按表1）在各比色管中加入溶液,沸水浴反应5min ,冷却加蒸馏水定容至25mL 后,以去离子水作为空白校正,用紫外分光光度计于550nm下测A值。

三、褐藻酸酶活力测定- DNS 法3 ,5-二硝基水杨酸法测定酶活力 ,利用比色法测定酶解后还原产物的生成量 ,以表示酶的活力。

具体为:吸取 1 mL 发酵液 ,2 mL 1 %褐藻酸钠溶液(pH7. 0 的 1/ 15N 的磷酸缓冲液配制) ,于试管中混匀 ,并且以 1 mL 蒸馏水替代发酵液做空白对照实验。

置于40 摄氏度水浴糖化30 min ,取出后立即于沸水中煮沸 15 min 使酶失活。

冷却 ,过滤 ,吸取 1 mL 滤液于比色管中 ,加入 3 ,5-二硝基水杨酸显色剂3 mL,再沸水浴 15 min ,冷却 ,用蒸馏水定容至 25 mL ，混匀 ,在 550 nm 下测光密度(用蒸馏水调零) 。

酶活力单位定义为 ,在实验条件下 ,每毫升酶发酵液每分钟催化底物生成 1μg还原糖所需的量。

4、菌株的产酶曲线的测定在复筛培养基中接入2mL 对数生长期的菌株一组,从48小时起，每隔18--24h测量发酵液的酶活力,并且测量发酵液于550nm下的A值,从而做出产酶曲线，得到最大酶活时间并为以后的测定提供参考时间。

实用文档之DNS法测定总糖和还原糖

实用文档之"实验九总糖和还原糖的测定（二）"──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。

（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

（5）0.1% 酚酞指示剂。

（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5葡萄糖含量(mg)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。

DNS法测定总糖和还原糖

实验九总糖和还原糖的测定（二）──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。

（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g 酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

（5）0.1% 酚酞指示剂。

（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。

四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号试剂0 1 2 3 4 5 6 7 8葡萄糖标准液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4水杨酸溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5葡萄糖含量(mg)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。