DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度

DNS法测定发酵液中葡萄糖浓度

一、实验原理

在碱性条件下，葡萄糖与DNS（3，5-二硝基水杨酸）试剂反应，葡萄糖被氧化成糖酸及其他产物，DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，葡萄糖的量与棕红色物质颜色的深浅相关，利用分光光度计，在550nm波长下测定吸光度值，查标准曲线并计算便可求出样品中葡萄糖的含量。

二、材料与试剂

1．仪器：50ml容量瓶，1000ml容量瓶，500ml烧杯，小烧杯，试管（带刻度25ml更好）10根，棕色瓶

2.试剂：

1）葡萄糖

2）2mol/LNaOH溶液

3）酒石酸钾钠（C4H4O6KNa﹒4H2O，Mr=282.22）

4）结晶酚（C6H5OH,Mr=94.11）

5）无水亚硫酸钠（Na2SO4,Mr=126.04）

6）蒸馏水

7）DNS

8）DNS试剂配制：准确称取DNS 6.3g于500ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/LNaOH溶液262ml，再加到500ml含有酒石酸钾钠185g的热水溶液中，再加结晶酚5g和无水亚硫酸钠5g，搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

9）葡萄糖标准溶液配制：取适量葡萄糖装入称量瓶，再85°C烘箱烘至恒重，放入干燥器冷却。精确称取干燥后的葡萄糖0.5g加蒸馏水溶解，至50ml容量瓶定容，制成10g/L的葡萄糖溶液。分别取蒸馏水稀释成葡萄糖标准液，浓度为

0.2g/L,0.4g/L,0.6g/L,0.8g/L,1.0g/L,1.2g/L,1.4g/L,1.6g/L,1.8g/L,2.0g/L。

三、实验步骤

1.标准曲线制作

分别取标准液1.0ml于25ml刻度试管中，按下表加入试剂，沸水中显色5min。用

冷水冷却到室温后，加水至25ml，摇匀，再550nm处用分光光度计测定上述各溶

液的A550值。以葡萄糖浓度为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标

2.发酵液中还原糖的测定

1）发酵液过滤或离心得到上清液。

2）用蒸馏水将上清液稀释到0.2—2.0g/L。

3）取稀释后的发酵滤液1.0ml于25ml刻度试管中，加入DNS试剂3.0ml，沸水中显色5min。

4）冷却到室温后，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，在分光光度计波长550nm处测定溶液的A550值。

四、数据记录

1．制作标准曲线，计算标准曲线方程，y=ax+b,y为葡萄糖浓度（g/L），x为该浓度下A550值。

2．记录发酵稀释滤液的A550值。

3．计算发酵液中还原糖浓度：将测得发酵稀释滤液的A550值代入标准曲线方程，算得浓度，再乘以稀释倍数，即为发酵液中还原糖浓度。