2004年诺贝尔化学奖

三 ̖ 泛素介导的蛋白质降解的应用
• 阿弗拉姆·赫尔什科1937年出生在匈牙利，犹太 后裔，13岁移民以色列，现年67岁，1969年在耶 路撒冷希伯来大学获得医学博士学位，曾在旧金 山加州大学从事研究，1972年起在以色列工学院 任教。2004年10月6日获诺贝尔化学奖
• 欧文·罗斯现年78岁，1952年在芝加哥大学获得 博士学位，现就职于美国加利福尼亚大学欧文分 校。三名获奖者自20世纪70~80年代以来就一直致 力于这一领域的研究。 • 1970年代末，赫什科借着带薪休假的机会，带着 当时还是博士后的切哈诺沃，到美国费城福克 斯·蔡斯癌症研究中心的罗斯实验室进行访问研 究，在那里完成了三位获奖者的大部分合作研究， 发表了一系列生物化学论文。
• 1977年开始阿弗拉姆·赫尔什科致力于研究网状 细胞提取物。在试图利用色谱法除去血红蛋白的 过程中，阿龙·切哈诺沃和阿弗拉姆·赫尔什科 发现此提取物可被分为两个部分，当两部分融合 在一起时，就会产生ATP依赖性的蛋白质降解。 1978年，他们认为这种活性来源于一个多肽。这 种多肽（APF-1）分子量只有9000，即为泛素。
• 1和3：E1、E2催化的泛素激活反应，消耗ATP；2： E3催化的蛋白质激活反应，消耗ATP；4：依赖于 E3的蛋白质泛素化反应；5：不依赖于E3的蛋白质 泛素化反应；6：26S蛋白体催化蛋白质水解；7和 8：异肽酶催化的水解反应，使泛素游离出来。
去泛素化作用是泛素化过程的逆转。在真核细胞内 已发现多种去泛素化酶,它们能够水解泛素和底物 蛋白之间的硫酯键,还能把错误识别的底物从泛素 化复合体中释放出来。它们又可以分为两类:
• 在活性位点目标蛋白质被降解成7~9个氨基酸长度 的短肽片段后，从蛋白酶体的另一段被释放。此 外，19S复合物上还含有选择性，具有选择性的是E3酶，它只 对待降解的蛋白质进行泛素化标记。
6 ̖“多步泛素引发”学说
在后来的研究中，三位科学家及其成员们发现了 与此相关的3种酶，分别命名为E1、E2、E3，并且 在据此提出了“多步泛素引发”假说，即在人体 细胞中含有多种E1酶、E2酶、E3酶。蛋白质在细 胞内的降解的过程： （1）1、E1类酶激活泛素，该过程需要ATP（三磷 酸腺苷）提供一定能量； （2）泛素分子被转移到E2酶上； （3）E3酶识别待降解的目标蛋白质（靶蛋白）， E2-泛素复合物结合到目标蛋白质附近，泛素标记 物从E2酶转移到目标蛋白质上； （蛋白质的泛素化） （4）E3酶释放已被泛素标记的蛋白；
2004年诺贝尔化学奖
泛素介导的蛋白质降解
目录
一 ̖ 人物简介 二 ̖ 泛素介导的蛋白质降解的内容 三 ̖ 泛素介导的蛋白质降解的应用
四 ̖ 展望
一 ̖ 人物简介
2004年度诺贝尔化学奖授予两位以色列科学家阿龙·切哈诺 沃、阿弗拉姆·赫尔什科和美国科学家欧文·罗斯，以表彰 他们发现了泛素调节的蛋白质降解，也就说说他们发现了一 种蛋白质死亡的重要机理。
8 ̖ 泛素化和去泛素化
泛素通过E1和E2被激活的过程称为泛素的活化。
泛素的活化过程是一个依赖ATP的酶促反应：
①首先泛素活化酶 ( ubiquitin activatingenzyme E1 ) 催化泛素 C 末端的甘氨酸 ( Gly) 形成 Ub － 腺苷酸中间产物 , 然后激活的泛素 C 末端被转移至 E1酶内Cys残基的－SH键上,形成高能硫酯键;
ATP
蛋白酶体
降解
7 ̖ 泛素识别靶蛋白的机制
• 靶蛋白通过被泛素途径的酶E2或E3识别而被泛素 化修饰，通常是通过识别靶蛋白的特定Lys 残基 而将泛素连接到靶蛋白上。有时对靶蛋白的识别 还需要特定位点的磷酸化并且要达到一定的磷酸 化阈值。 • 除此之外还有另外两种识别机制，即N-end 规则 和一种新的区别于N-end 规则的N 端氨基酸残基 识别机制
②含有高能硫酯键的泛素通过转酰基作用使其进一 步转移到泛素载体蛋白( ubiquitin conjugating enzyme, E2) 特异的 Cys 残基上 , 形成 E2 － Ub 巯基 酯;E2－Ub巯基酯提供泛素分子,使泛素C端甘氨酸 与底物蛋白的Lys 残基的氨基形成共价键 , 由第一 个泛素单体与底物蛋白内部的 Lys 残基的 ε 氨基 (或β 氨基)结合;
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• （5）重复最后一 步，直至蛋白质上 连接的多个泛素形 成一条短链； • （6）泛素短链在 蛋白酶体开口处被 识别，泛素标记物 被切除，蛋白质被 切割成小片段。
泛素介导的蛋白质降解过程
泛素分子
被激活 被激活的泛素分子
E3 E2
激 活 E1 E2 需降解的 蛋白质
多泛素化
泛素介导的蛋白质降解过程
• 在1960年，人们发现了溶酶体这个及其重要的细 胞器，他被认为是蛋白质降解的重要场所。后来 人们发现了溶酶体抑制剂，经过细胞溶酶体机能 抑制剂的作用后，细胞内任然存在部分蛋白质的 分解难以抑制。表明在细胞内存在与溶酶体不同 的蛋白分解系统。
• 在1975年，就有人从牛胸腺中分离出一种含76个 氨基酸残基的多肽，相对分子质量为8.45ku,后来 被证实具有标记待降解蛋白质的作用，由于它广 泛存在于生命体，因此被命名为“泛素”。 • 1977年，Goldberg等报道网织红细胞（未发育成 熟的红细胞）的提取液中加入ATP显著促进蛋白质 的分解，也就是说蛋白分解伴随着能量的消耗， 在细胞外，蛋白质在蛋白酶的催化下水解释放能 量，蛋白质在细胞内被降解却需要能量，给科学 家们造成了很大的困扰。
• 在宣布大厅，切哈诺沃笑言，还没来得及把消息 告诉亲朋好友，也没想以后怎么用这笔奖金， “在此刻，我觉得我已经不是我自己了！当记者 问到，作为一名非美国人赢得科学类的诺贝尔奖 有什么感受，他激动地说：“我深深为我的祖国 感到骄傲！”切哈诺沃还说，他相信他们的发现 对攻克癌症以及多种疾病会有很大帮助。
9 ̖
泛素调节蛋白质降解的发现史
• 1953年，当时Simpson 利用放射性同位素标记法 进行蛋白质代谢实验，并随后发表了名为“生物 细胞中的蛋白质分解中需要代谢能量即需要ATP的 加水分解”的论文，但是，这个惊人的研究发现 并没有引起科学界的广泛重视，甚至为人们所忽 略。在当时的热力学研究中，水分解反应是产能 反应，与合成反应需要能量的过程是截然不同的。
生物体内细胞中蛋白质的降解
异常蛋白 短周期蛋白 80-90% 内质网相关 蛋白 长周期蛋白 泛素-蛋白酶体途径
氨基酸 小肽
膜蛋白 10-20% 细胞外蛋白 溶酶体途径
2 ̖ 泛素调节的蛋白质降解概述
• 蛋白质的降解是一个精细控制的过程，首先有待 降解的蛋白质被一种多肽（称之为泛素）所标记 （蛋白质的泛素化），接着这些泛素化的蛋白质 进入细胞的蛋白酶复合体的活性位点，蛋白质被 降解成7~9个氨基酸长度的短肽片段后，从蛋白酶 体的另一段被释放。
二 ̖
1 ̖
泛素介导的蛋白质降解
生物体内蛋白质的两种降解过程:
• 一种：溶酶体，不需要能量，无选择性的降解。 主要是降解细胞通过胞吞作用摄取的外源蛋白质。 • 另一种：需要能量，高效率、指向性很强的降解 过程。比如多数细胞内的蛋白质降解。这个过程 需要泛素调节蛋白质降解，即泛素—蛋白酶体途 径( UPP )介导的蛋白水解过程
• 此结果说明了此种识别机制中是N端氨基酸残基而 不是靶蛋白中的Lys残基决定了靶蛋白的泛素化修 饰。但保留靶蛋白的N 端氨基酸残基而将N 端氨 基酸序列中的一个或某几个氨基酸残基替换也会 导致靶蛋白不能被泛素化修饰[28]，此结果说明 了是N 端氨基酸序列而不是N 端第一个氨基酸蕴 涵了靶蛋白的泛素化修饰信息。通常靶蛋白的特 异性是由E2 或E3 决定的，但现在发现多聚泛素 链连接蛋白可以将靶蛋白招募到蛋白酶体，并且 对泛素蛋白酶系统特异性选择靶蛋白起一定作用
• N-end 规则一般是针对于不稳定的蛋白质而言(若 N 端第一个氨基酸是Phe、 Leu、 Trp、Tyr、 Ile、 Arg、Lys和His等时此蛋白质为不稳定蛋白 质)[27]，泛素系统识别靶蛋白N端的不稳定氨基 酸，然后将泛素连接到靶蛋白特定或非特定的Lys 残基的ε 氨基基团上。
• 区别于N-end 规则的N 端氨基酸残基识别机制一 般是针对于某些N 端并不是不稳定氨基酸残基的 靶蛋白，泛素系统识别靶蛋白N端氨基酸序列蕴涵 的泛素化修饰信息从而将靶蛋白泛素化标记。对 于此种识别机制，L y s 残基不是必须，靶蛋白 中所有Lys 残基被剔除后仍然被泛素化修饰降解， 但与野生型相比泛素化修饰率偏低；与此相对应 的是N 端氨基酸残基的去除则导致此蛋白质不能 被泛素化修饰。
③泛素可以直接从 E2 转移给底物蛋白形成 Ub 蛋白复 合物,这时的底物多是些碱性蛋白(如组蛋白) ,而 在大多数情况下,底物蛋白先与泛素连接酶 ( ubiquitin ligating enzyme, E3) 特 异 性 结 合 ,E3 可使E2 和底物蛋白相互接近 , 继而蛋白底物 与E2酶连接的泛素结合,这样就完成了底物蛋白质 的泛素化。
3 ̖ 泛素的结构与组成
泛素含有 76 个氨基 酸残基 , 广泛存在 于真核生物 , 目前 尚未发现泛素存 在于原核生物中， 泛素的氨基酸序 列极其保守。泛 素基因主要编码 两种泛素前体蛋 白质 : 一种是多聚 泛素 , 另一种是泛
4 ̖ 泛素—蛋白酶体途径( upp )的组成
泛素—蛋白酶体途径 ( upp ) 由泛素( ubiquitin, ub) 以及一系列相关的酶组成。 除泛素以外还包括4 种 酶家族:泛素活化酶 ( E1 ) 、泛素偶连酶 (E2)也称泛素载体蛋白 、 泛素-蛋白连接酶( E3) 和蛋白酶体 (proteasome) 。
（ 1 ）泛素羧端水解酶 ( ubiquitin C - terminal hydrolases (UCHs) )：分子量为20～30 KD,水解 去除和泛素 C 末端连接的小肽 , 也参与泛素多聚体 产生泛素单体的过程 , 促进泛素再循环 , 对泛素系 统的正常运行是很有必要的。