蛋白质的显色反应
最新实验一 蛋白质及氨基酸的显色反应(验证)
操作步骤:
一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10% 氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩 脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反 应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。
操作步骤
一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火 加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停 止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后， 加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入 1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜 色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化 铜能掩盖粉红色。
二、在一小片滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸 溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮 乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察 紫红色斑点的出现。
Ⅲ、黄色反应 (Xanthoproteic reaction)
原理
凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用 产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性 溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。
管号
１
0
0.3％ 蛋白质 20％ α －萘 NaClO 现象
精氨 溶液 NaOH 酚
记录
酸
0
5
5
3
6
２
0
5
0
5
3
6
３
5
0
0
5
3
6
Ⅴ、乙醛酸反应 (AdamkiewicaHopkins-Cole reaction)
蛋白质的颜色反应和沉淀反应
蛋白质作为食品添加剂
ห้องสมุดไป่ตู้
01
蛋白质可以作为食品添加剂，如乳化剂、增稠剂等，改善食品
的口感和质地。
蛋白质作为营养强化剂
02
蛋白质可以作为营养强化剂添加到食品中，提高食品的营养价
值。
蛋白质在功能性食品中的应用
03
蛋白质可以用于制备功能性食品，如低脂、低糖、高纤维等。
在农业领域的应用
1 2
蛋白质作为肥料
蛋白质可以作为有机肥料，提供植物所需的营养 元素，促进植物生长。
质谱分析法
总结词
通过测量蛋白质离子的质量和电荷比值，可 确定蛋白质的分子量和结构。
详细描述
质谱分析法利用高能电子束或激光将蛋白质 离子化，然后在电场和磁场中进行分离和检 测。通过测量离子的质量和电荷比值，可以 确定蛋白质的分子量和结构。质谱分析法具 有高灵敏度和高分辨率的特点，是蛋白质纯 度检测的重要手段之一。
详细描述
考马斯亮蓝G-250是一种灵敏的染料，可以与蛋白质结合产生颜色变化，通过比色法可以测定蛋白质的含量。该 方法具有高灵敏度和准确性，被广泛应用于生物化学实验中蛋白质的定量分析。
02
蛋白质的沉淀反应
盐析法
总结词
通过向蛋白质溶液中加入高浓度的盐 溶液，降低蛋白质溶解度，使其从溶 液中沉淀出来。
紫外吸收法
总结词
紫外吸收法是一种利用蛋白质在紫外光区有特征吸收峰 的性质来定量测定蛋白质含量的方法。
详细描述
紫外吸收法的基本原理是蛋白质分子中的共轭双键在紫 外光区有特征吸收峰，通过测定特定波长下的吸光度值 ，可以计算蛋白质的含量。该方法具有较高的灵敏度和 准确性，适用于测定各种蛋白质，包括球蛋白、纤维蛋 白等。
实验一 蛋白质的颜色反应和沉淀反应.DOC附图
实验一蛋白质的颜色反应和沉淀反应一、实验目的（1）掌握鉴定蛋白质的原理和方法（2）熟悉蛋白质的沉淀反应；进一步掌握蛋白质的有关性质二、实验原理（1）蛋白质颜色反应原理：蛋白质分子中的某些或某种基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，是一些常用蛋白质定量测定的依据；但颜色反应不是蛋白质的专一反应；1、米伦反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。
他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。
组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。
2、双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。
双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3、黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。
4、茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。
此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。
亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。
（2）蛋白质沉淀反应原理：多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
1、蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。
于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。
盐析作用一般不使蛋白质变性。
2、有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀3、重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。
蛋白质的显色反应
蛋白质的显色反应GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-实验二蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应1、双缩脲反应（1）原理：尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2, -CH2-NH2, -CHR-NH2, -CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2）试剂①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）（3）操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应(1) 原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。
蛋白质的显色反应
蛋白质的显色反应集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-实验二蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应1、双缩脲反应（1）原理：尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2,-CH2-NH2,-CHR-NH2,-CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2）试剂①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水=1：9）（3）操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL ，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水=1：9）约1mL 和10%氢氧化钠溶液约2mL ，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应 (1)原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有?-氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。
生化实验实验三-蛋白质颜色反应及沉淀反应
实验三蛋白质颜色反应及沉淀反应一、目的1、掌握鉴定蛋白质的原理及方法。
2、熟悉蛋白质的沉淀反应。
3、进一步掌握蛋白质的有关性质。
二、原理蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸种类不同，颜色反应亦不同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。
颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定性被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
三、实验器材1、鸡蛋白2、试管3、吸管4、滴管5、水浴锅等四、实验试剂1、卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
2、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。
3、10%氢氧化钠溶液：10g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至100ml。
4、浓硝酸：比重1.42。
5、1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。
6、饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。
7、95%乙醇。
8、结晶氯化钠。
9、1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。
10、饱和苦味酸溶液。
11、1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。
五、操作1、颜色反应：A、双缩脲反应：蛋白质分子中含有肽键，与两分子尿素经过加热形成的双缩脲的结构相似，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物。
取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
B、黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸。
遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物。
于一试管中加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。
C、茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。
蛋白质及氨基酸的显色反应
第二讲蛋白质及氨基酸的显色反应一、实验目的：1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理蛋白质分子中因含有某种特殊氨基酸或某种结构，可与多种化合物作用，产生各种颜色反应。
这种颜色反应可作为蛋白质的定性和定量实验。
三、实验仪器、试剂和材料1、仪器：试管及试管架、试管夹、水浴锅、电陶炉。
2、试剂和材料：蛋白质溶液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20倍，用2-3层纱布过滤，滤液冷藏备用。
0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。
尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。
10%NaOH溶液、浓硝酸（比重1.42）、1%硫酸铜溶液、浓硫酸（A·R）、冰醋酸（C·P）、0.5%谷氨酸钠溶液、0.5%甘氨酸溶液、0.5%醋酸铅溶液、浓盐酸、红色石蕊试纸。
四、显色反应1、双缩脲反应：原理：如将脲素加热，则两分子脲素放出一分子氨而形成双缩脲。
双缩脲在碱性环境中硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子含有多个肽键与双缩脲结构相似，故能呈此反应，形成紫红或蓝紫色的络合物。
双缩脲反应可用于好、鉴定蛋白质的存在及蛋白质水解是否完全用比色法可作蛋白质的定量测定。
步骤：（1）取少量结晶尿素（火柴头大小）放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸（遇酸变红，遇碱变蓝）试之，至试管内有白色固体出现停止加热(熔解至硬化，刚硬化时即停止加热），冷却。
然后加10％氢氧化钠溶液1ml摇匀，再加2滴1％硫酸铜溶液，混匀，观察颜色变化。
（2）另取一试管，加蛋白溶液（含有多个多肽键）约10滴，再加10％氢氧化钠溶液10滴及1％硫酸铜溶液2滴，混匀。
观察颜色变化。
2、茚三酮反应原理：除脯氨酸、羟脯氨酸外与茚三酮生成黄色物质外，所有a-氨基酸都能和茚三酮反应生成蓝紫色化合物。
蛋白质浓硝酸显色反应方程式
蛋白质浓硝酸显色反应方程式
蛋白质浓硝酸显色反应是一种常用的蛋白质检测方法，常用于检
测蛋白质的存在和浓度。
本文将简要介绍蛋白质浓硝酸显色反应方程
式及其应用，以期能够为读者提供一定的指导意义。
蛋白质浓硝酸显色反应的基本步骤是，将待测样品与浓硝酸混合
后产生深黄至橙色的颜色反应。
其方程式如下：
R-CH(NH2)-COOH + 3HNO3 → R-NO2 + CO2 + 2H2O + 3NO2
其中，R代表蛋白质的氨基酸残基。
反应机理是硝化反应，即硝酸与蛋白质中氨基基团反应生成亚硝基化合物。
这种反应具有明显的时间和浓度效应，在一定的条件下（如反应
温度、反应时间、硝酸浓度等），样品中存在的蛋白质数量与反应产
物的颜色深度成正相关。
因此，通过比色法（如分光光度法）或比较
法（如半定量比较）可以对蛋白质在样品中的含量进行测定。
该方法主要用于生物医学、食品、农业、环境等领域中对蛋白质
的快速、简单、定量测定，存在一定的优点和局限性。
优点是该方法
灵敏度高、适用于大部分蛋白质和复合物的检测；局限性是该方法不
适用于含有硝酸还原酶、氧化酶、亚硝酸还原酶等有干扰效应的样品，且部分蛋白质可能会与硝酸生成氧化物，影响检测结果。
总之，了解蛋白质浓硝酸显色反应方程式有助于更深入地理解蛋白质的化学性质和检测方法，同时也有助于科学家们在实验中更加准确、高效地应用该方法。
2、蛋白质的显色反应
实验二蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应1、双缩脲反应（1）原理：尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2, -CH2-NH2,-CHR-NH2, -CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2）试剂①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）（3）操作取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约1mL和10%氢氧化钠溶液约2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应(1) 原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。
蛋白质的颜色反应原理
蛋白质的颜色反应原理
蛋白质的颜色反应原理可以归纳为以下几种：
1. 酸性染料反应原理：染料分子通过酸性基团与蛋白质上的碱性氨基酸相互作用，形成染色复合物。
这种反应常用于蛋白质的染色和分离。
2. 比尔斯反应原理：毕尔斯反应是一种氧化还原反应，它基于蛋白质中含有的巯基团（-SH）与汞离子（Hg2+）作用，生成黑色或棕色沉淀物。
这种反应常用于检测蛋白质中巯基的存在。
3. 铜离子反应原理：铜离子（Cu2+）与蛋白质中的酪氨酸残基或麦氨酸残基相互作用，形成蓝色或紫色化合物。
这种反应常用于定量测定蛋白质的含量。
4. 尿素反应原理：尿素在碱性溶液中与二肽结构形成化合物，通过酸性染料的染色，可以根据染色的深浅来判断蛋白质含量的多少。
需要注意的是，蛋白质的颜色反应原理是一种定性和定量分析蛋白质的方法，具体的反应机制、染色剂和条件可以根据实验设计的要求进行选择和调整。
实验2 蛋白质的显色反应
NH2 C O NH + C O NH2
O H H O N C N H CH O
3 NH2
2 NH2
Cu2+
OH-
C N NH Cu C HN O H
紫红色化合物
双缩脲反应除肽键以外，—CS—NH2，— CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2— NH2—CHNH2—CH2OH或— CHOHCH2NH2等基团 NH2 NH2 以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物 质也有此反应。NH3因与Cu2+生成暗蓝色的 络离子Cu（NH3）42+干扰此反应。 有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质 或多肽。
茚三酮反应原理
脯氨酸与茚三酮 反应的产物为黄 色化合物
还原茚三酮
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨 基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大 时甚至不显色。 该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水 溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测 定方法。
2．试剂： ①蛋白质溶液 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水 =1∶9） ②0.5%甘氨酸溶液 ③0.1%茚三酮水溶液 ④0.1%茚三酮-乙醇溶液
实验2 蛋白质与氨基酸的呈色反应
一、双缩脲反应 二、茚三酮反应 三、黄色反应 四、考马斯亮蓝反应
一、实验目的：
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、实验原理、试剂及操作流程
（一）双缩脲反应
1.原理
2.试剂
蛋白质溶液（鸡蛋清∶水=1∶20）；
考马斯亮蓝染液
3.实验操作
蛋白质与浓硝酸的显色反应
蛋白质和浓硝酸的反应
（蛋白质的鉴定）
实验目的：观察蛋白质与浓硫酸的反应现象
实验用品：
蛋白质（牛奶或蛋青或豆浆），浓硝酸，试管，胶头滴管。
实验步骤：
1、将蛋白质（适量）放在一支试管中，并用胶头滴管向其中滴加几滴浓硝酸。
2、振荡试管。
实验现象：
可以看到，蛋白质立即变成黄色。
实验扩展：
利用该实验的现象，可以简单的互相鉴别蛋白质和浓硝酸，验证了理科的互通性，在高中阶段，尤其体现在生物学与化学的互通及相辅相成。
实验原理：浓硝酸与蛋白质作用，是其变性，并显黄色，这是蛋白质继双缩脲显色反应之后的又一显色反应。
最新实验一 蛋白质及氨基酸的显色反应(验证)备课讲稿
乙醛酸反应
试剂 （滴） 管号
1
白明胶
蛋白质溶 冰醋酸 液（滴） （ml）
5
1
浓硫酸 （ml）
1
现象记录
2
1
1
3
5
1
1
Ⅵ、偶氮反应 (Azo reaction)
原理 偶氮化合物 (偶氮试剂)与酚核或咪唑环结合产生
有色物质。它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别 为红色和樱桃红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白 质也有此反应。
子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝
相似的物质。色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反
应也形成有色物质。很多人用含有少量醛杂质
的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。
操作步骤
向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸 (常含 有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾斜试管，谨 慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1mL，使其重迭，且 勿使二者混合。静置后，观察在两液界面上出现 的红紫色环，于水浴中微热，可加快色环形成。
二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴， 由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀， 小火加热，则沉淀变为黄色，冷却，逐滴加入 10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄 色。
三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴 浓硝酸，观察颜色变化。
黄色反应
管号 材料
量（滴)
浓硝酸 （滴） 现象
1 0.5％苯
该反应灵敏度达 1：250 000。因此常用于定 量测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白 质。
操作步骤
取3支试管，分别加入1mL蒸馏水、0.3%精 氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氢氧化钠溶液5 滴，1%α-萘酚酒精溶液3滴，次氯酸钠溶液6滴， 摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。
实验2 蛋白质的显色反应-07
四、坂口反应
1.实验原理
精氨酸和许多胍代化合物与，α－萘
酚在碱性次溴酸钠溶液中发生反应，
产生红色物质。此反应可用于定性鉴
定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精
氨酸。
2.试剂
（1）0.3%精氨酸溶液10mL
（2）蛋白质溶液100mL（配法见黄色反应） （3）20%氢氧化钠溶液100mL （4）1% α－萘酚－乙醇溶液20mL（临用时配制） （5）次溴酸钠溶液10mL
三黄色反应na硝基酚黄色邻硝醌酸钠橙黄色多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸所以有黄色反应苯丙氨酸不易硝化需加入少量浓硫酸才有黄色反应
实验二 蛋白质与氨基酸的显色反应
一、双缩脲反应 二、茚三酮反应 三、黄色反应 四、坂口反应 五、考马斯亮蓝反应
二0一0年十月
一、双缩脲反应 一、目的：
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
紫红色化合物
双缩脲反应除肽键以外，—CS—NH2，— CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2— CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团 NH2 NH2 以及乙二酰二胺（O＝C—C＝O）等物质也 有此反应。NH3因与Cu2+生成暗蓝色的络离 子Cu（NH3）42+干扰此反应。 因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双 缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定 都是蛋白质或多肽。
0.5 ml 0.1％茚三酮
蛋白质溶 液 1ml
甘氨酸溶 液 1ml
沸水浴1－ 2min
三、黄色反应
1．原理：
• 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色 氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质， 该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄 色的硝醌酸钠。反应式如下：
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实验二蛋白质的显色反应
一、实验目的
1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。
2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应
1、双缩脲反应
（1）原理：
尿素加热至180o C左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应（二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应）。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
反应式如下：
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2, -CH2-NH2,
-CHR-NH 2, -CH 2-NH 2-CH-NH 2-CH 2-OH 或-CHOHCH 2NH 2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。
NH 3也干扰此反应，因为NH 3与Cu 2+
可生成暗蓝色的络离子Cu （NH 3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
（2）试剂
①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9） （3）操作
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1mL ，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色）
向另一试管加2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约1mL 和10%氢氧化钠溶液约2mL ，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
2、茚三酮反应 (1) 原理
蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应 ，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。
氨、β-丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。
尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。
该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱羧成醛，放出CO 2、NH 3，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。
反应机理如下：
C
C
C OH
OH
+
H 2N
C H COOH
R
O
O C
C C OH H
+
NH 3
+CO 2+R
C
O
H
O O
还原型茚三酮
该反应非常灵敏，1：150万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在，另一方面要在适宜的PH 条件下进行测定。
该反应的适宜的PH 为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
（2）试剂
①蛋白质溶液：2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9），②0.5%甘氨酸，③0.1%茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。
（3）操作
①取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1mL ，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混匀，在沸水浴中加热1～2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝色（pH 不同颜色深浅不同）。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
3、黄色反应 （1）原理
含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
反应式如下
C
C C O O
H
N
C
C C
O
O
+
3H2O
蓝紫色
HO
+
HNO 3HO
NO 2
N O -
Na +
O
硝基酚（黄色）
邻硝醌酸钠（橙黄色）
C
C C OH
H +
NH 3
O O 还原型茚三酮
+
C C C
HO
HO
O
O
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。
（2）试剂
①鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用6层纱布过滤，然后按鸡蛋清：水=1：20配制而成。
②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
③头发。
④指甲。
⑤0.5%苯酚溶液。
⑥浓硝酸。
⑦0.3%色氨酸溶液。
⑧0.3%酪氨酸溶液。
⑨10%氢氧化钠溶液。
（3）操作
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化（1 ～4管可能需要加热）。
4、考马斯亮蓝反应
（1）原理
考马斯亮蓝G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01 ～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
（2）试剂
①蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20配制而成）。
②考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G250100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水至100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%。
（3）操作
取两支试管，按下表操作
结果分析：要分析结果，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？
实验报告不能用铅笔写。