AD转基因小鼠的鉴定
AD小鼠模型介绍
AD小鼠模型介绍AD小鼠模型，即阿尔茨海默病小鼠模型，是一种用于研究阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的动物模型。
阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为认知功能障碍和记忆力丧失。
目前还没有有效的治疗方法，因此研究AD的机制和治疗方法变得至关重要。
AD小鼠模型是研究该疾病的重要工具之一AD小鼠模型通常通过基因工程技术构建，根据不同的基因突变或操纵来模拟AD发病机制和临床表现。
这些小鼠通常表现出与人类AD患者相似的一些病理特征，如神经元损伤、β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白磷酸化等。
通过对这些AD小鼠模型的研究，科学家可以更好地了解AD的发病机制，寻找新的治疗方法和药物靶点。
目前，AD小鼠模型已经被广泛应用于AD病理生理学研究、新药筛选和临床药物评估等领域。
下面将介绍一些常见的AD小鼠模型及其特点：1. APP/PS1双转基因小鼠：这是最常见的AD小鼠模型之一，它通过表达人类APP（β淀粉样前体蛋白）和PS1（presenilin-1）基因，模拟AD的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
这种模型通常表现出记忆力损失、神经退化等AD病理生理学特征。
2. 3xTg-AD小鼠：这是一种同时表达人类APP、PS1和tau蛋白P301L基因的三转基因小鼠。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出早期记忆障碍和晚期神经元损伤等表型。
3.Tg2576小鼠：这是一种表达人类APP基因的转基因小鼠模型。
该模型主要用于研究β淀粉样蛋白在AD发病中的作用，通常表现出大量的β淀粉样蛋白沉积和神经元损伤等特征。
4. 5xFAD小鼠：这是一种表达人类APP、PS1和tau蛋白基因的五转基因小鼠模型。
该模型不仅模拟了β淀粉样蛋白和tau蛋白在AD发病中的作用，还表现出更加严重的神经元损伤和认知功能障碍等表型。
除了以上几种常见的AD小鼠模型外，还有许多其他基因操纵小鼠模型被用于AD的研究。
DNA片段大小对制备转基因小鼠整合效率的影响
【 关键词】 外源Ｄ Ａ 转基 因小鼠； Ｎ ； 整合
［ 中图分 类号】 ９ —３ ［ Ｑ ５３ 文献 标识码 ］ 【 Ａ 文章编 号］ ６ ４５ １（０ ２０ ． １ ６０ １ ７ —８ ７２ １）２０ ．４ １
一
１ 材 料 与方 法
１１ 试 剂 、仪 器 与材 料 ．
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［ 收稿 日期］ ０ １０ —０ ２ １ －５３ 【 作者 简介］ 池 骏（９ ２）男， １８一 ，
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油 购 自 Ｓｉ ｍａ公 刊 。体 视 显 微 镜 、 倒 置 显 微 镜 ｇ Ｏ ｙ ｕ 公司产 品： ｌｍｐ ｓ 显微 注射 系统及 制针 设备购 自Ｕ 本 Ｎａｉ ｉ 公 司： 胎培 养器皿 Ｆ ｌ ｎ３ ３ 、３ ０ ； ｒ ｈｇ ｓ ｅ 胚 ａｃ ０ ７ ０ ３ ｏ 原 核 注 射 针 、 持 卵针 、 胚 胎 移 植 针 、注 射 ＥＳ细 胞 针 等 自制 。
转基因小鼠安全评估
转基因小鼠安全评估
转基因小鼠是指经过人为基因改造的小鼠，通过插入外源基因来改变其遗传性状。
在进行转基因小鼠的安全评估时，需要对以下几个方面进行考虑：
1. 基因插入点的稳定性：转基因小鼠需要确认基因插入点是否稳定，避免插入点导致其他遗传变化或异常表达。
2. 基因导入的效率和选择性：确定基因导入的效率和选择性，要保证转基因小鼠中目标基因的表达水平和模式与预期一致。
3. 对小鼠生理和行为特征的影响评估：进行转基因小鼠的生理和行为特征的全面评估，比较其与野生型小鼠的差异，确保转基因过程没有引起明显的异常。
4. 对小鼠健康状况的评估：进行转基因小鼠的健康状况的评估，包括常规的血液学、生化学、组织学等指标的检测。
5. 长期观察评估：对转基因小鼠进行长期观察，了解其寿命、生殖能力、疾病发生率等方面的变化。
如果有异常，需要进一步研究其与转基因过程的关联性。
6. 繁殖和传代评估：对转基因小鼠的繁殖能力和后代的遗传特征进行评估，确保基因改造的稳定性和传代的可靠性。
总之，转基因小鼠的安全评估是一个复杂的过程，需要综合考虑基因插入的稳定性、对生理和行为特征的影响、对健康状况
的评估等多个方面。
这些评估结果将有助于确定转基因小鼠的安全性和可靠性，为进一步的研究提供基础。
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略基因工程小鼠是研究基因功能和疾病机制的重要模型生物，它们通过基因工程技术进行特定基因的敲除、突变或过表达，从而模拟人类疾病的发生和发展过程。
然而，饲养和繁育基因工程小鼠以及对其进行鉴定是一个复杂而关键的过程。
本文将介绍基因工程小鼠饲养繁育及鉴定的策略。
一、基因工程小鼠饲养繁育策略1. 选择合适的饲养环境：基因工程小鼠对其饲养环境的要求较高，应提供适宜的温度、湿度和光照条件，以及清洁的饮水和饲料。
饲养箱应定期消毒，确保小鼠的健康生长。
2. 选择合适的饲料：基因工程小鼠的饲料应根据其基因改造的特点进行调整。
例如，敲除特定基因的小鼠可能需要特殊的饲料补充物来维持其生存和生长。
3. 繁殖管理：基因工程小鼠的繁殖需要进行严格的管理。
通常采用配对交配的方式进行繁殖，确保后代的基因遗传稳定。
此外，对于一些特殊基因型的小鼠，可能需要进行人工授精或胚胎移植等技术手段来实现繁殖。
4. 健康监测：定期对基因工程小鼠进行健康监测，包括体重、行为观察和疾病筛查等。
如发现异常情况，应及时采取相应的处理措施，以保证小鼠的健康状况。
二、基因工程小鼠鉴定策略1. 基因型鉴定：通过PCR、Southern blotting、Western blotting等技术来检测基因工程小鼠是否成功敲除、突变或过表达目标基因。
这些技术可以通过检测目标基因的DNA或蛋白质来确定小鼠的基因型。
2. 表型鉴定：基因工程小鼠的表型鉴定是评估其外部表现和生理特征的过程。
通过观察小鼠的行为、外貌、器官形态等方面的变化，可以初步判断基因改造对小鼠的影响。
3. 功能鉴定：基因工程小鼠的功能鉴定是评估其基因改造对生物学功能的影响。
可以利用行为学实验、生理学指标测定、组织学分析等技术手段来评估小鼠的功能变化，进一步揭示基因改造对生物过程的影响机制。
4. 遗传稳定性鉴定：基因工程小鼠的遗传稳定性鉴定是评估其基因改造是否稳定传递给后代的过程。
ad小鼠模型评价标准
ad小鼠模型评价标准
AD小鼠模型的评价标准主要包括以下几个方面：
1. 体重变化：观察小鼠体重的增长情况，可以间接反映模型的健康状况。
2. 皮肤病变：观察皮肤炎症等病变的情况，如红斑、水肿、鳞屑等，以及皮肤炎症的严重程度和范围。
3. 嗜酸性粒细胞浸润：检测皮肤中嗜酸性粒细胞的浸润情况，嗜酸性粒细胞在AD模型中通常会增加。
4. 血清总IgE浓度：检测血清中总IgE的浓度，IgE的升高通常与过敏反应有关，也是AD的重要特征之一。
5. 病理学分析：通过病理学分析，观察皮肤炎症、表皮增生、真皮血管增生等病理改变。
6. 行为学观察：观察小鼠的行为变化，如抓挠、舔舐等自发的搔痒行为，以及焦虑、抑郁等情绪变化。
综合以上几个方面的观察和检测结果，可以对AD小鼠模型进行评价。
AD小鼠模型介绍
AD动物模型分类 5. APP/PS1转基因AD小鼠模型
该模型以C57BL/6J小鼠为背景,转入了含有瑞典型(Swedish) 突变位点的APP基因(K595N/M596L),同时还含有第9个外显子删 除的PS1突变基因
APP/PS1双转基因AD小鼠模型在3月龄时出现学习和记忆缺 陷,6月龄时脑内可见明显的老年斑沉积,12月龄时可见大量的老年 斑形成,具有和AD相似的病理表型
宗园媛, 王晓映, 王海林,等. APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析 [J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(9):8-12.
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
通过将APPSwe和tauP 301L同时显微注射进PS1M 146V 基因敲入小鼠的单细胞胚胎中,得到了携带APPSwe, tauP 301L, PS1M 146V基因的三重转基因小鼠—3x Tg-AD小鼠
AD动物模型分类 6. 3xTg-AD小鼠模型
3x Tg-AD小鼠是目前最接近家族型阿尔茨海默病的动物模型, 它具有AD的主要神经病理学特征—SP和NFT,脑中出现神经元死 亡、突触丢失等AD的重要病理变化,且该转基因动物模型由于认 知障碍出现、病理发生较早,使得研究过程更加经济快速
祝艳秋, 张兰. 基于3xTg-拟阿尔茨海默病小鼠模型的药理学研究进展[J]. 中国比较医学杂志, 2015, 25(2):61-66.
AD动物模型分类 3.腹腔注射东莨菪碱
东莨宕碱能选择性地阻断M受体，使突触后乙酰胆碱含 量变化，影响某些酶系变化，继而影响细胞内外钙离子含 量，导致神经细胞死亡，引起痴呆的病理生理变化。
董洪涛, 房繄恭. 多因素AD动物模型的建立及针刺对其学习记忆功能的影响[J]. 上海中医药杂 志, 2002, 36(5):43-46.
转基因小鼠和显微注射以及验证
转基因小鼠和显微注射以及验证目录转基因小鼠制备实验方法 (2)Southern Blot原理及实验方法 (4)Northern Blot原理及实验方法 (6)RFLP标记 (12)1.点的多态性 (13)2.序列多态性 (14)显微注射实验操作 (14)转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析
阿尔兹海默病(AD)小鼠脑内P-糖蛋白(P-gp)的表达与功能分析杜丽莎;杨青【摘要】目的研究P糖蛋白(P glycoprotein,P-gp)在APP/PS1双转基因阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠脑中的表达与功能情况.方法采用RT-PCR、real-time PCR和Western blot方法分析不同月龄的AD小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠脑中P gp表达的差异;采用尾静脉注射罗丹明123 (Rhodamine 123,Rh123),HPLC检测脑及血清中Rh123的含量,计算脑血分配系数,分析不同月龄的AD小鼠和WT小鼠脑中P gp功能的差异.结果 3月龄时,AD 小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显低于WT小鼠;6月龄时,AD小鼠与WT小鼠无明显差异;9月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达与功能均明显高于WT小鼠;12月龄时,AD小鼠脑内P-gp的表达高于WT小鼠,功能却低于WT小鼠.结论 AD小鼠脑内P-gp的表达与功能与WT小鼠明显不同,并随月龄而变化.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2014(041)004【总页数】6页(P441-446)【关键词】阿尔兹海默症(AD);P-糖蛋白(P-gp);APP/PS1双转基因小鼠;β淀粉样蛋白(Aβ)【作者】杜丽莎;杨青【作者单位】复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433;复旦大学生命科学学院生物化学系上海200433【正文语种】中文【中图分类】R742.8+9;Q513阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，其发病机理复杂，目前尚无定论。
β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的产生与清除失衡导致Aβ大量沉积是AD主要病理特征之一，有效减少Aβ在脑中的沉积是被广泛探索的AD治疗途径之一[1-3]。
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是MDE1基因的表达产物，相对分子质量(Mr)为170 000。
小鼠转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
阿尔兹海默症小鼠评价指标和实验方法
阿尔兹海默症小鼠评价指标和实验方法阿尔兹海默症（Alzheimer's Disease，AD）小鼠的常用评价指标和实验方法主要包括以下几种：1. 条件性恐惧实验：这是一种基于巴普洛夫的条件反射原理设计的实验，可用于评估小鼠对特定环境刺激的记忆能力。
实验中，小鼠被置于特定环境中，并给予一个声音信号作为条件刺激，紧接着给予电击作为非条件刺激。
小鼠在恐惧时会出现静止状态，即除了呼吸之外无其他任何活动的防御姿势。
随后在相同或不同的环境中测试小鼠静止状态的持续时间，以评估其条件恐惧程度和记忆能力。
该实验对于评估AD动物模型的焦虑状态和环境条件刺激记忆功能具有良好效果。
2. 放射状迷宫（八臂迷宫）实验：这是一种用于评估小鼠空间学习和记忆能力的实验方法。
在一个八臂迷宫中，小鼠需要通过探索各个臂来找到食物。
通过比较造模前后小鼠在迷宫中的表现，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
3. Morris水迷宫实验：这是一种评估小鼠学习和记忆能力的行为学实验。
在一个圆形水池中，小鼠需要寻找一个隐藏的平台以逃离水面。
通过记录小鼠寻找平台的时间和路径，可以评估其空间学习和记忆能力。
该实验可以用于检测AD模型小鼠的空间认知障碍。
4. 一般行为学观察：包括观察小鼠的精神状态、毛发、饮食以及开场行为（在新环境中的探究活动）等变化。
这些观察可以提供有关小鼠整体健康状况和行为表现的信息，有助于发现与AD相关的非认知行为变化。
5. 生物标志物检测：通过检测小鼠脑组织中淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白等生物标志物的含量和分布，可以评估AD的病理进展。
这些标志物在AD 患者脑中沉积形成老年斑和神经纤维缠结，导致神经元死亡和认知障碍。
检测这些标志物可以帮助了解AD模型小鼠的病理状态，并可作为药物筛选的指标之一。
6. 神经电生理检测：通过记录小鼠脑电波活动和神经元放电情况，可以评估其神经功能和信息处理能力。
PCR步骤
转基因小鼠的鉴定一，剪鼠尾1,剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2,分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天；c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天；d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。
3,剪鼠尾后对小鼠的标记一般在小鼠的耳朵或指甲上做标记，如果在用剪指甲来标记的话，时间过长则不易分辨。
所以一般还是选择用左右耳朵上剪的刀数来标记，正常情况下一笼小鼠不会超过10只，依次标记为左1刀，右1刀，左2刀，右2刀，左1右1刀，左2右1刀，左1右2刀，左2右2刀，左3刀，最后一只不剪耳。
二，从鼠尾中提取DNA1,剪0.5cm的鼠尾，放入1.5ml的EP管中。
2,加入500μlSNET,其中蛋白酶K浓度是400μl/ml。
注：SNET鼠尾裂解液配方（100ml）：200mM的Tris-Cl 取1M的Tris-Cl（PH8.0）2ml5mM的EDTA 取0.5M的EDTA（PH8.0）1ml400mM的NaCl 取2.34g1%（m/v）SDS 取10ml 10%SDS加水定容至100ml临用时加蛋白酶K400μg/ml，即100ml的SNET加40mg。
3,放入550C孵育过夜（最好放入摇床550C振荡过夜，也可放入550C烘箱过夜，第2天摇床550C振荡2~3个小时）。
4，消化好后，每只EP管内加入14μl 6M NaCl溶液，涡轮振荡仪上剧烈振荡30s-1min。
5,12000rpm离心10min，取上清400μl 到另一1.5mlEP管内。
注：a离心时EP管对称放置且最好开口处靠近轴部；b取“另一1.5mlEP管”时，选择盖子内部正常无多余部分，以免第6步的絮状沉淀挂在多余部分。
小鼠基因型鉴定步骤
小鼠基因型鉴定步骤小鼠是生命科学中最常用的实验动物之一，它们的基因型鉴定可以帮助研究者确定小鼠的基因组信息，从而更好地研究小鼠在不同生物学领域中的作用。
下面将介绍小鼠基因型鉴定的步骤。
1.收集小鼠组织样本小鼠基因型鉴定的第一步是收集小鼠组织样本，一般来说，可以选择小鼠的血液、尾部组织、口腔粘膜等组织作为样本。
其中，尾部组织是最常用的样本类型之一，因为采集方便，不会对小鼠造成太大的伤害。
2.提取DNA收集完小鼠组织样本后，需要从样本中提取DNA。
DNA提取的方法有很多种，例如盐酸-SDS法、琼脂糖法等。
其中，盐酸-SDS法是最常用的DNA提取方法之一，其原理是通过盐酸和SDS的作用将细胞膜和核膜破坏，释放出DNA，然后通过酒精沉淀的方式提取纯化DNA。
3.扩增DNA片段提取出的DNA需要进行扩增，扩增的目的是增加DNA的数量，方便后续的基因型鉴定。
扩增DNA片段的方法有很多种，例如聚合酶链式反应（PCR）法、限制性片段长度多态性（RFLP）法等。
其中，PCR法是最常用的DNA扩增方法之一，其原理是利用DNA 聚合酶复制DNA，将目标DNA片段扩增至足够数量。
4.电泳分离DNA片段扩增出的DNA片段需要进行电泳分离，以便在凝胶上观察和鉴定。
电泳是一种利用电场将带电粒子分离的技术，DNA分子在电场的作用下会向阳极移动，移动的距离与DNA片段的大小成正比。
因此，可以通过对DNA片段的大小进行比较，确定小鼠的基因型。
5.基因型鉴定在电泳分离后，可以通过染色剂或探针等方法对DNA进行染色或杂交，以确定小鼠的基因型。
例如，可以使用荧光素标记的探针对DNA片段进行杂交，根据探针杂交的位置来确定小鼠的基因型。
小鼠基因型鉴定包括收集小鼠组织样本、提取DNA、扩增DNA片段、电泳分离DNA片段和基因型鉴定等步骤。
通过这些步骤，研究者可以确定小鼠的基因型，从而更好地开展小鼠相关的生命科学研究。
阿尔兹海默症转基因小鼠模型研究进展及评价
2013年12月中国实验动物学报Dece mbe r，2013第21卷第6期A C T A L A B O R A T O R I U M A N I M A L I S S C l E N T I A S I N I C A V01．2l N o．6矿o“岿N5≈o匐；综述·进展女℃—e；}芒；}吨；；q譬；划阿尔兹海默症转基因小鼠模型研究进展及评价罕园园，马开利(中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所药物安全性评价研究中心，昆明650118)【摘要】随着世界人13的老龄化，阿尔兹海默症已经成为严重威胁老年人健康的主要疾病之一，研究并建立可靠的阿尔兹海默症动物模型对于探明疾病的病因、发病机制及防治药物的开发均具有重要意义。
本文就目前使用最为广泛和研究最为深入的转基因小鼠模型的病理、行为学变化特点及其在阿尔兹海默症研究中的应用和发现作一介绍。
【关键词】阿尔兹海默症；转基因小鼠模型【中图分类号】Q95—33【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2013)06-0097-06Doi：10．3969／j．issn．1005—4847．2013．06．020Research advances in transgenic mous e mo dels ofAlzhe ime r’S disease and their evaluationHA N Y ua n—y ua n，M A Ka i—li(Center fo r D r u g S af et y E valua tion an d R es e ar c h，In s ti t ut e of Medical Biology，Chinese A c a d em y ofMedical S ci e n c e s&P e k in g U n i o n Medical Col leg e，Kun ming650118，China)【Abstract】A s the wor l d p op ul a ti o n continues to age，A lz he im er’s di se as e h as b ec om e of t he major d is e as e s that thr ea te ns th e h ea lt h of the el der ly po pu la ti o n．I t is ver y impor tant to establi sh rel iable animal m ode l of A lz he ime r’S di se as e to clarify the di se a se e t io l og y，p a t ho g en e s is a n d p r o m o t e drug development．In this article w e will rev iew the m o s t wid el y used and t he m o s t in-de p th s tu di ed transg eni c m o u s e models with their p at ho lo gi ca l char acte ris tic s and b e h av i o r c ha ng es，a n d t he i r ap pl ic at ion in resea rches of Alz h e i me r's disease．【Key words】Al zh ei m er’S disease；Tran sgenic m o u s e model阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)的两大基础，具有明确病因，并能够模拟疾病最为重要的渐病理特征为老年斑(senile plaque，SP)和神经原纤进性退行性病变，同时出现可检测的行为缺陷∞J，维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，同时出现大可望成为研究AD发病机制及治疗药物的理想模量神经突触丢失和炎症反应所导致的神经元变型。
转基因小鼠鉴定实验
转基因小鼠鉴定实验
在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。
因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。
1．转基因整合检测
鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。
检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。
（1）基因组DNA的提取：
1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。
2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。
（2） PCR检测：转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。
该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。
由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。
因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。
假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。
PCR 实验应采用双复管，甚至三复管。
阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。
（3） Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。
Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。
2．转基因表达检测
转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。
而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。
其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。
AD转基因模型研究进展
• ApoE基因位于19号染色体，具有多态性，有3种等 ApoE基因位于19号染色体，具有多态性， 基因位于19号染色体 位基因ε2、ε3、ε4，分别表达ApoE2、ApoE3、 位基因ε2、ε3、ε4，分别表达ApoE2、ApoE3、 ε2 ApoE2 ApoE4， ApoE3最常见 最常见， 78％。ApoE4是AD相关 ％。ApoE4 ApoE4，以ApoE3最常见，占78％。ApoE4是AD相关 联的危险因素，对含有APP突变的FAD有促进作用， APP突变的FAD有促进作用 联的危险因素，对含有APP突变的FAD有促进作用， 但对具有PS突变的FAD PS突变的FAD没有作用 但对具有PS突变的FAD没有作用[4]。
转早老蛋白（PS）基因小鼠
• PS基因位于14号染色体，中枢神经系统PS主要集 PS基因位于14号染色体，中枢神经系统PS主要集 基因位于14号染色体 PS 中在海马和皮层内。PS是一种跨膜蛋白，可在细 中在海马和皮层内。PS是一种跨膜蛋白， 是一种跨膜蛋白 胞中与APP形成复合物，参与APP APP形成复合物 APP转运 胞中与APP形成复合物，参与APP转运 及合成后加 已发现至少有35 PS基因突变与AD有关 35种 基因突变与AD有关， 工。已发现至少有35种PS基因突变与AD有关，野 生型PS有抗凋亡作用；突变型PS易裂解， PS有抗凋亡作用 PS易裂解 生型PS有抗凋亡作用；突变型PS易裂解，可诱导 神经元内Aβ增多。 Aβ增多 神经元内Aβ增多。
双转基因小鼠
• APPswe／PSl小鼠 APPswe／PSl小鼠 Wengennck等 制作了APPswe Wengennck等[5]制作了APPswe ／PS转基因小鼠，表达人突变的PS基因和APP基因， PS转基因小鼠，表达人突变的PS基因和APP基因， 转基因小鼠 PS基因和APP基因 12周后在转基因鼠皮质和海马发现Aβ沉积 周后在转基因鼠皮质和海马发现Aβ沉积， 12周后在转基因鼠皮质和海马发现Aβ沉积，此后 到第54 54周 Aβ沉积明显增加 此模型用于研究PS 沉积明显增加。 到第54周，Aβ沉积明显增加。此模型用于研究PS Aβ沉积中的作用 沉积中的作用。 在Aβ沉积中的作用。
AD小鼠模型介绍
AD小鼠模型介绍AD小鼠模型，即阿尔茨海默病小鼠模型，是研究阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，简称AD）的常用动物模型。
阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病，以认知障碍和记忆损害为主要特征，对患者的生活质量和家庭经济状况产生巨大影响。
转基因AD小鼠模型最早由L. Mucke团队于1995年创建。
这些转基因小鼠是通过将人源的突变前体蛋白质（amyloid precursor protein，APP）或其酶切产物的基因导入小鼠胚胎中，使其在大脑中过度表达β-淀粉样蛋白（amyloid-beta，Aβ），从而模拟AD患者大脑中β-淀粉样物质的沉积。
这些模型具有遗传稳定、可重现性好、Aβ沉积明显等特点，适用于研究Aβ沉积的动态变化和与其相关的病理生理学改变。
但由于转基因技术的限制，这些模型在建模之前就存在人为设计的缺陷，不完全反映人类疾病的自然历程，并且建模以及后续研究成本较高。
诱导AD小鼠模型是通过给予小鼠β-淀粉样蛋白前体的特定片段、神经毒性物质或化学药物等来诱导Aβ的沉积。
例如，诱导小鼠模型中最为常用的是通过给予β-胰岛素A肽（amylin）而诱导Aβ的形成。
这类模型具有好的可控性，可以通过调整给药剂量和方法来模拟AD的不同发展阶段，但模型建立和操作过程相对复杂，且一些诱导方式可能会导致非特异性的神经损伤。
1. 病理特征和病理生理学改变：通过观察模型小鼠大脑中Aβ的沉积情况、Tau蛋白的磷酸化等病理改变，以及相关神经元损伤和炎症反应等，揭示AD发病机制。
2.认知和行为表现：通过行为学测试，评估模型小鼠的认知和学习能力、空间记忆和工作记忆等，以反映AD小鼠模型的行为改变，从而评估新药对这些行为的干预效果。
3.药物疗效评价：通过给予模型小鼠潜在的抗AD药物，观察其对病理特征、记忆损害和认知功能的影响，评价药物的疗效，以及探讨药物的作用机制。
尽管AD小鼠模型在阿尔茨海默病研究中发挥了重要作用，但由于其与人类疾病的差异以及实验条件的限制，模型存在一定的局限性。
AD 实验报告
AD 实验报告一、实验背景AD（阿尔茨海默病）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。
临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。
随着人口老龄化的加剧，AD 的发病率逐年上升，给社会和家庭带来了沉重的负担。
因此，深入研究 AD 的发病机制和寻找有效的治疗方法具有重要的现实意义。
本次实验旨在探究某种新型药物对 AD 模型小鼠认知功能的改善作用，为 AD 的治疗提供新的思路和依据。
二、实验材料与方法（一）实验动物选用健康的雄性 C57BL/6 小鼠，8 周龄，体重 20-25g。
将小鼠随机分为三组：正常对照组（Control 组）、AD 模型组（Model 组）和药物治疗组（Treatment 组），每组 10 只。
（二）AD 模型的建立采用双侧海马注射Aβ1-42 寡聚体的方法建立 AD 模型。
具体操作如下：小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠（40mg/kg）进行麻醉，固定于立体定位仪上。
参照小鼠脑立体定位图谱，以前囟为零点，在双侧海马（AP：－20mm，ML：±15mm，DV：－20mm）缓慢注射Aβ1-42 寡聚体（5μl/侧，1μg/μl），注射速度为05μl/min，留针 5min 后缓慢拔出针头，缝合头皮。
（三）药物治疗Treatment 组小鼠在模型建立后第7 天开始给予新型药物灌胃治疗，剂量为 10mg/kg，每天 1 次，连续治疗 4 周。
Control 组和 Model 组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃。
（四）行为学检测1、水迷宫实验在药物治疗 4 周后，进行水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力。
实验分为定位航行实验和空间探索实验。
定位航行实验：将小鼠从不同的入水点放入水中，记录小鼠找到隐藏平台的时间（逃避潜伏期），每天训练 4 次，连续训练 5 天。
空间探索实验：在第 6 天撤去平台，记录小鼠在目标象限（原平台所在象限）的停留时间和穿越原平台位置的次数。
AD转基因小鼠的鉴定
转基因小鼠的鉴定、剪鼠尾1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2.分辨小鼠的年龄a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天；c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天；d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。
3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下：1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡混匀。
2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。
3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离。
、，I •、、+ :注意：1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。
4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。
5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。
APPPS1（AD）双转基因小鼠品系介绍
APPPS1（AD）双转基因小鼠品系介绍
APP/PS1小鼠(AD)双转基因的小鼠可表达突变的人类早老素(DeltaE9)和人鼠淀粉样前蛋白(APPswe)融合体，APP/PS1(AD)双转基因小鼠这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。
人类早老素基因的DeltaE9突变是该基因的第九个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。
对小鼠脑蛋白匀浆进行免疫检测发现，人类早老素蛋白高水平地替代了可检测到的小鼠内源性蛋白，并且，在APP/PS1(AD)双转基因的小鼠脑匀浆中还检测到了人源淀粉样前蛋白。
据研究者报道，6-7月龄的APP/PS1(AD)双转基因小鼠脑内会形成beta淀粉状蛋白沉淀。
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转基因小鼠的鉴定
、剪鼠尾
1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾
剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。
2.分辨小鼠的年龄
a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；
b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天；
c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天；
d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；
e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；
f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。
3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法
、从鼠尾中提取DNA
采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下：
1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡
混匀。
2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。
3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,
使样品均匀分离。
、，I •、、+ :
注意：
1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。
4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌
的离心管中。
5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混
匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。
2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。
3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。
6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可
分多次转入。
10000rpm离心1mi n,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm
离心1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中
8.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm
离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
如需进一步提高DNA 纯度，可重复步骤8。
9.12000rpm 离心2min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCF等）。
10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200
卩I Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集DNA 溶液，-20 C保存DNA
1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。
2）离心前室温孵育5min 可增加产量。
3）用另外的50-200卩L Buffer GE 或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4）如果需要提高DNA勺终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10;若洗脱体积小于200卩L,可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产
量。
PCR
PCR程序设定：
1 = 94.0 C for 5:00 2=94.0 C for 1:00
3= 59.0 C for 0:50
4= 72.0 C for 1:00
5= Goto 2 2times
6= 94 C for0:50
7= 58C for 0:50
8= 72C for 1:00
9= Goto 6 2times
10= 94.0 C for 0:50
11=56.0C for 0:50
12= 72.0 C for 1:00
13= Goto10 32times
14= 72.0 C for 10:00
15= 4.0 °C for 5:00
16= END
目前实验室的双转基因小鼠 AD 体系采用:
PCF 反应的体系（
12卩I ）: APP Primer APP-1 1.3 卩 I Primer APP-2 1.3 卩 l ddHO 2 卩 l mix (CW068) 6 卩 l DNA 1卩1 PS1 Primer PS1-1 1.3 卩 l Primer PS1-2 1.3 卩 l 内参-1 1 卩l 内参-2 1 ixl mix (CW068) 6 卩 l DNA PCF 反应的体系（
12卩I ）
: 卩1
先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq 酶混合均匀，最后再在各PCF管中依次加入DNA羊品。
引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol , 使用前先用12000rpm离心1min，加入10x卩l ddH 2O,涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100卩M的母液，取10卩l的母液，用ddHO稀释10倍，即加入90卩l，混匀后即可得到10卩M的引物工作液。
四、电泳
1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11 齿。
分别用的
0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。
用1.5%的琼脂糖凝胶。
2.点样：12卩l的DNA Marker加5卩l。
点样时注意逐个点样，不要点错，最好
把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。
Marker的选择依基因片段大小而定。
3.跑电泳：打开电源，150v 电压，30min 左右即可。
4.照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。
5.保存。