AD转基因小鼠的鉴定

转基因小鼠的鉴定

、剪鼠尾

1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾

剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。

2.分辨小鼠的年龄

a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生；

b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天；

c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天；

d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右；

e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右；

f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。

3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法

、从鼠尾中提取DNA

采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下：

1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡

混匀。

2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。

3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,

使样品均匀分离。

、，I •、、+ :

注意：

1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。

2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。

4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌

的离心管中。

5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混

匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。

3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。

6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可

分多次转入。10000rpm离心1mi n,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm

离心1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中

8.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm

离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA 纯度，可重复步骤8。

9.12000rpm 离心2min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCF等）。

10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200

卩I Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm离心1min，收集DNA 溶液，-20 C保存DNA

1）如果下游实验对PH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱，洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响，若用水作洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5直接，PH值低于7.0时洗脱效率不高。

2）离心前室温孵育5min 可增加产量。

3）用另外的50-200卩L Buffer GE 或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4）如果需要提高DNA勺终浓度，可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤10;若洗脱体积小于200卩L,可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产

量。

PCR

PCR程序设定：

1 = 94.0 C for 5:00 2=94.0 C for 1:00

3= 59.0 C for 0:50

4= 72.0 C for 1:00

5= Goto 2 2times

6= 94 C for0:50

7= 58C for 0:50

8= 72C for 1:00

9= Goto 6 2times

10= 94.0 C for 0:50

11=56.0C for 0:50

12= 72.0 C for 1:00

13= Goto10 32times

14= 72.0 C for 10:00

15= 4.0 °C for 5:00

16= END

目前实验室的双转基因小鼠 AD 体系采用:

PCF 反应的体系（

12卩I ）: APP Primer APP-1 1.3 卩 I Primer APP-2 1.3 卩 l ddHO 2 卩 l mix (CW068) 6 卩 l DNA 1卩1 PS1 Primer PS1-1 1.3 卩 l Primer PS1-2 1.3 卩 l 内参-1 1 卩l 内参-2 1 ixl mix (CW068) 6 卩 l DNA PCF 反应的体系（

12卩I ）

: 卩1

先在1.5ml的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中（一般多加两小管的量），将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次（尽量避免产生气泡）以便Taq 酶混合均匀，最后再在各PCF管中依次加入DNA羊品。

引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后，EP管上会有标记，一般为x nmol , 使用前先用12000rpm离心1min，加入10x卩l ddH 2O,涡旋振动混匀，微型离心机离心，即可得到100卩M的母液，取10卩l的母液，用ddHO稀释10倍，即加入90卩l，混匀后即可得到10卩M的引物工作液。

四、电泳

1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种，分别用的梳子为50、25、11 齿。分别用的

0.5*TBE的量为90ml、45ml、25ml。用1.5%的琼脂糖凝胶。

2.点样：12卩l的DNA Marker加5卩l。点样时注意逐个点样，不要点错，最好

把中间的那个孔留着点Marker，这样可避免点样的出错。Marker的选择依基因片段大小而定。

3.跑电泳：打开电源，150v 电压，30min 左右即可。

4.照胶：看是否有目的条带，即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子。

5.保存。