《凝胶过滤色谱填料》PPT课件
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第六章凝胶过滤.ppt
交联度
吸水量
膨胀度
分离对象的大小
编号
大 小
交联度 吸液量
小
大
大
小
膨胀 速度 慢 快
凝胶 网孔 大 小
分离限
大 小
凝胶 强度 小 大
商品葡聚糖凝胶的规格
型号、颗粒大小、分离范围、吸水量、膨胀 度、溶胀时间。
G后面的编号为膨胀度的10倍。 如： sephadexG-25表示每克干胶吸水量为2.5ml。
Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白 聚糖，甚至大的病毒颗粒（直径＞300－400nm）也 可用它分离。
五、Superdex
Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖 共价结合而成的。
该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学 稳定性。在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度 可在pH3-12范围内变化，溶液中加入去污剂(如1 ％SDS)和(或)解离剂(如8mol/L尿素、6mol／L盐 酸胍)时，也不会影响分离效果。
美国的为Bio－GA，有6个型号: 即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和 150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。
浓度大，分离范围小，颗粒强度大。
CL交联琼脂糖： Sepharose与1，3-二溴异丙醇 在强碱条件下生成的。比琼脂糖的稳定性提高， PH范围3-14。
三、聚丙烯酰胺凝胶
其筛分效果受操作条件(如基质的颗粒大小、均 匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及 样品的种类等)的影响是显而易见的，但更为直接的 影响是Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效果好； Kav值差异性小、乃至等于1或等于零(即使样品中各 组分的分子质量相差很大)，则分离效果很差，或根 在不能分开。
《凝胶排阻》课件
结果分析
在观察结果时，应进行正确的结果分析，避免误 判或遗漏。
03
凝胶排阻实验结果分析
实验结果展示
蛋白质分子量分布图
通过电泳技术，将蛋白质在凝胶上进 行分离，并使用染色技术使其显色， 从而得到蛋白质的分子量分布图。
凝胶排阻柱色谱图
通过色谱技术，将蛋白质混合物通过 凝胶排阻柱进行分离，并使用紫外检 测器进行检测，得到凝胶排阻柱色谱 图。
总结词
利用凝胶排阻技术分离糖类物质
详细描述
糖类物质分离实验中，凝胶排阻技术同样发挥了重要作用。通过选择合适的凝胶介质和实验条件，可 以将不同糖类物质根据分子量进行分离。该技术为糖类物质的定性和定量分析提供了有效手段，在糖 生物学和生物制药等领域具有广泛的应用价值。
06
总结与展望
凝胶排阻实验的总结
未来发展方向与展望
新型色谱柱的开发
随着高分子材料和制备技术的发 展，未来将开发出新型的色谱柱 填料，提高分离效果和分辨率。
联用技术应用
将凝胶排阻实验与其他分析技术联 用，如质谱、核磁共振等，可以实 现高分子结构和性质的更深入分析 。
智能化和自动化
未来凝胶排阻实验将更加智能化和 自动化，提高实验效率和数据处理 速度，减少人为误差。
分子量范围判断
根据实验结果判断蛋白质分子 的分子量范围，从而确定蛋白 质的种类和数量。
结论总结
综合实验结果和数据分析，得 出关于蛋白质分子量和分子尺 寸的结论，为后续研究提供依 据。
04
凝胶排阻实验改进与优化
实验条件的优化
01
02
03
04
温度控制
优化温度条件，确保实验过程 中温度的稳定，以提高实验结
果的准确性。
在观察结果时，应进行正确的结果分析，避免误 判或遗漏。
03
凝胶排阻实验结果分析
实验结果展示
蛋白质分子量分布图
通过电泳技术，将蛋白质在凝胶上进 行分离，并使用染色技术使其显色， 从而得到蛋白质的分子量分布图。
凝胶排阻柱色谱图
通过色谱技术，将蛋白质混合物通过 凝胶排阻柱进行分离，并使用紫外检 测器进行检测，得到凝胶排阻柱色谱 图。
总结词
利用凝胶排阻技术分离糖类物质
详细描述
糖类物质分离实验中，凝胶排阻技术同样发挥了重要作用。通过选择合适的凝胶介质和实验条件，可 以将不同糖类物质根据分子量进行分离。该技术为糖类物质的定性和定量分析提供了有效手段，在糖 生物学和生物制药等领域具有广泛的应用价值。
06
总结与展望
凝胶排阻实验的总结
未来发展方向与展望
新型色谱柱的开发
随着高分子材料和制备技术的发 展，未来将开发出新型的色谱柱 填料，提高分离效果和分辨率。
联用技术应用
将凝胶排阻实验与其他分析技术联 用，如质谱、核磁共振等，可以实 现高分子结构和性质的更深入分析 。
智能化和自动化
未来凝胶排阻实验将更加智能化和 自动化，提高实验效率和数据处理 速度，减少人为误差。
分子量范围判断
根据实验结果判断蛋白质分子 的分子量范围，从而确定蛋白 质的种类和数量。
结论总结
综合实验结果和数据分析，得 出关于蛋白质分子量和分子尺 寸的结论，为后续研究提供依 据。
04
凝胶排阻实验改进与优化
实验条件的优化
01
02
03
04
温度控制
优化温度条件，确保实验过程 中温度的稳定，以提高实验结
果的准确性。
凝胶渗透色谱GPC课件
混合凝胶柱GPC-80M
19
GPC色谱柱选择
按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系 列
THF、氯仿、 DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围 内，并且最好是处在校正曲线线性范围内
2
标样
聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)
将公式(2)代入公式(3)和(4)，则：
(5)
(6)
标样的Mw和Mn已知，将Hi,Vi代入，软件自动算出A,B值。
3
GPC分析大致步骤
根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标 样，并且确定采用的GPC校正方法
配制标样和样品，用LCsolution进样得到色 谱图
用LCsolution GPC生成校正曲线并计算样 品平均分子量，制作报告
渐进试差法(宽分布标样校正法)
这种方法不需要窄分布样品，其标样可为1~3 个不同相对分子质量的宽分布标样(平均相对
2
分子质量精确测量， Mw和Mn为已知)，采用
窄分布标样校正法
要有5个以上的不同分子量的单分散标样来 制作校正曲线
样品最好与标样是相同的结构。
如果样品与标样结构完全一样，则结果不需再 修正
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质
标样数量最少可以只有1个 标样的分子量Mw和Mn必须已知 标样校正曲线呈线性
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
在一定条件下，有： (1)
将标样色谱峰分成若干个切片，则： (2)
根据定义，有：
(3)
(4)
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分 布曲线；
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GPC色谱柱选择
按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系 列
THF、氯仿、 DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物
按照样品分子量范围来选择柱子型号
样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围 内，并且最好是处在校正曲线线性范围内
2
标样
聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)
将公式(2)代入公式(3)和(4)，则：
(5)
(6)
标样的Mw和Mn已知，将Hi,Vi代入，软件自动算出A,B值。
3
GPC分析大致步骤
根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标 样，并且确定采用的GPC校正方法
配制标样和样品，用LCsolution进样得到色 谱图
用LCsolution GPC生成校正曲线并计算样 品平均分子量，制作报告
渐进试差法(宽分布标样校正法)
这种方法不需要窄分布样品，其标样可为1~3 个不同相对分子质量的宽分布标样(平均相对
2
分子质量精确测量， Mw和Mn为已知)，采用
窄分布标样校正法
要有5个以上的不同分子量的单分散标样来 制作校正曲线
样品最好与标样是相同的结构。
如果样品与标样结构完全一样，则结果不需再 修正
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质
标样数量最少可以只有1个 标样的分子量Mw和Mn必须已知 标样校正曲线呈线性
3
渐进试差法(宽分布标样校正法)
在一定条件下，有： (1)
将标样色谱峰分成若干个切片，则： (2)
根据定义，有：
(3)
(4)
用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分 布曲线；
凝胶渗透色谱PPT课件
研发历程：
1953年--Wheaton和Bauman-用多孔树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物 质，观察到分子尺寸排除现象。
1959年--Porath和Flodin— 用葡聚糖凝胶分离了水溶液中不同分子量的样品。
1962年--J.C.Moore— 将连续式高灵敏度的示差折光仪接在分离柱后，并以体积计 量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量 分布的测定仪，创立了凝胶渗透色谱技术。 凝胶渗透色谱 GPC---Gel Permeation Chromatography 也称作体积排斥色谱 SEC---Size Exclusion Chromatography 以溶剂作流动相，流经多孔填料作为分离介质的液相色谱 法。
色谱柱
预热板
加热废液管儿 放空阀
废液 溶剂
溶剂输送系统
典型分离式GPC系统示意图
I Out n
在线脱气
为GPC加热的理由
降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理 想的GPC状态（如Polyethylene – Terphthalate m-Cresol + 0.05 m LiBr/100 °C）
16
18
20
– [] ST = VI / RI – H = MST [] ST – Polynomial fit to Log H
22
24
26
28
for each standard for each standard universal calibration curve
“绝对”分子量分布的测定
Log [] = Log K + Log M K 及 可随 M 变化
GPC中的大分子结构形态
1953年--Wheaton和Bauman-用多孔树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物 质，观察到分子尺寸排除现象。
1959年--Porath和Flodin— 用葡聚糖凝胶分离了水溶液中不同分子量的样品。
1962年--J.C.Moore— 将连续式高灵敏度的示差折光仪接在分离柱后，并以体积计 量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量 分布的测定仪，创立了凝胶渗透色谱技术。 凝胶渗透色谱 GPC---Gel Permeation Chromatography 也称作体积排斥色谱 SEC---Size Exclusion Chromatography 以溶剂作流动相，流经多孔填料作为分离介质的液相色谱 法。
色谱柱
预热板
加热废液管儿 放空阀
废液 溶剂
溶剂输送系统
典型分离式GPC系统示意图
I Out n
在线脱气
为GPC加热的理由
降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理 想的GPC状态（如Polyethylene – Terphthalate m-Cresol + 0.05 m LiBr/100 °C）
16
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– [] ST = VI / RI – H = MST [] ST – Polynomial fit to Log H
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for each standard for each standard universal calibration curve
“绝对”分子量分布的测定
Log [] = Log K + Log M K 及 可随 M 变化
GPC中的大分子结构形态
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件
二、生物分子的相对分子质量、分子大小和形状
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
6
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
3
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
4
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
9
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
7
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
色谱分离技术凝胶筛分课件
溶质在流动相停留的时间分数 qm 1 qs qm 1k'
在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向
前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移
动速度(u b )总是小于流动相的移动速度(u m )，而等于流
动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时
间分数之积：
ub um(11k')
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工 成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型 号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺 凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美 国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共 10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的 排阻限度。
无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶 颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以 外的其他效应。
优点：
可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具 有较高的柱效率和分离度。
缺点：
pH的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH范围在 2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速 率加快，减少柱子寿命。
层析分离操作过程
液相色谱的基本原理和参数
保留时间(tR)和保留体积(VR)
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所
需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间
内冲洗剂（流动相）
VR tR•F
流过的体积为保留体积，用VR 表示。
理论塔板数的计算公式为：
N (tR )2
色谱流出曲线及参数
容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两
在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向
前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移
动速度(u b )总是小于流动相的移动速度(u m )，而等于流
动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时
间分数之积：
ub um(11k')
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工 成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型 号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺 凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美 国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共 10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的 排阻限度。
无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶 颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以 外的其他效应。
优点：
可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具 有较高的柱效率和分离度。
缺点：
pH的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH范围在 2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速 率加快，减少柱子寿命。
层析分离操作过程
液相色谱的基本原理和参数
保留时间(tR)和保留体积(VR)
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所
需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间
内冲洗剂（流动相）
VR tR•F
流过的体积为保留体积，用VR 表示。
理论塔板数的计算公式为：
N (tR )2
色谱流出曲线及参数
容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两
凝胶渗透色谱PPT课件
• 校正曲线的测定方法很多，大致可分为两大类 即直接校正法和间接校正法。
单分散性标样校正法
• 选用一系列与被测样品同类型的不同分子 量的窄分散性（）标样，先用其他方法精 确地测定其平均分子量，然后与被测样品 在同样条件下进行GPC分析。每个窄分布 标样的峰为淋洗体积与其平均分子量相对 应，这样就可做出lgM－V曲线如下图所示。
• 色谱原理 • 流动相:载气 • 固定相:固体吸附剂等
•
图 气相色谱对样品分离过程示意图
• 色谱谱图解析
• 一 谱图表示方法: 横坐标 时间
•
纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图
•
•
• 色谱图的解析: 色谱峰的位置
•
色谱峰的大小和形状
•
色谱峰的分离
• 保留值: 保留时间
•
死时间
•
调整保留时间 与固定液用量有
关
• 比保留体积 相对保留值 保留指数
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’
•
VR=VM+KVS
•
色谱的保留值与热力学系数联系起来
• 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形
•
塔板理论：高斯分布曲线
•
c 标准偏差：
2nct0Rexp12n1ttR
2
tR / n
c
c0
2
exp
t tR
2 2
3.凝胶色谱分离机理
凝胶色谱的色谱过程方程
• 凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分离 能力与填料孔径无关。
• GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架 体积、填料孔体积及填料颗粒间体积。其 中填料骨架体积对分离不起作用，柱空间 体积主要由后两部分组成。
单分散性标样校正法
• 选用一系列与被测样品同类型的不同分子 量的窄分散性（）标样，先用其他方法精 确地测定其平均分子量，然后与被测样品 在同样条件下进行GPC分析。每个窄分布 标样的峰为淋洗体积与其平均分子量相对 应，这样就可做出lgM－V曲线如下图所示。
• 色谱原理 • 流动相:载气 • 固定相:固体吸附剂等
•
图 气相色谱对样品分离过程示意图
• 色谱谱图解析
• 一 谱图表示方法: 横坐标 时间
•
纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图
•
•
• 色谱图的解析: 色谱峰的位置
•
色谱峰的大小和形状
•
色谱峰的分离
• 保留值: 保留时间
•
死时间
•
调整保留时间 与固定液用量有
关
• 比保留体积 相对保留值 保留指数
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’
•
VR=VM+KVS
•
色谱的保留值与热力学系数联系起来
• 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形
•
塔板理论：高斯分布曲线
•
c 标准偏差：
2nct0Rexp12n1ttR
2
tR / n
c
c0
2
exp
t tR
2 2
3.凝胶色谱分离机理
凝胶色谱的色谱过程方程
• 凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分离 能力与填料孔径无关。
• GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架 体积、填料孔体积及填料颗粒间体积。其 中填料骨架体积对分离不起作用，柱空间 体积主要由后两部分组成。
凝胶色谱法PPT课件
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泵系统：
包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和 一个高压泵。它的工作是使流动相（溶 剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工 作状况好坏直接影响着最终数据的准确 性。越是精密的仪器，要求泵的工作状 态越稳定。要求流量的误差应该低于 0.01mL/min。
-
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色谱柱：
GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心 细管中加入孔径不同的微粒作为填料。
聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开基本原理基本原理分离原理流动分离分离原理体积排除色谱secsizeexclusionchromatography让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙较大和粒子内的通孔较小
凝胶渗透色谱法
Gel Permeation Chromatography (GPC)
[η]1M1=[η]2M2 k1M1α1+1=k1M2α2+1 两边取对数：lgk1+(α1+1)lgM1=lgk2+(α2+1)lgM2 即如果已知标准样和被测高聚物的k、α值，就可 以由已知相对分子质量的标准样品M1标定待测样品的 相对分子质量M2。
-
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实验部分
GPC仪的组成：
泵系统、（自动）进样系统、凝 胶色谱柱、检测系统和数据采集 与处理系统。
-
7
校正原理
用已知相对分子质量的单分散标准聚合物 预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质 量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。聚 合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄 分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一 系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量 样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即 为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC 谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子 质量分布的信息。
凝胶渗透色谱(精选)PPT文档共42页
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
凝胶渗透色谱（精选）
6
、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容膝之易来自安。56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
凝胶渗透色谱（精选）
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7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
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9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
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60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
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容膝之易来自安。56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
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溶质只依据其分子体积（流体力学体积） 的大小而分离。
与其他色谱相比较的优点：
①出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi 和V0之间，且不需要梯度淋洗。
②溶质与固定相（填料）和流动相之间没 有相互作用。 ③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上， 故柱寿命长。
与其他色谱相比较的优点：
④可用于测定生物大分子的分子量 ⑤生物相容性好，有很高的活性回收 率 ⑥负载量较大，利于制备分离。
凝胶过滤色谱的渗透极限：
指的是可用于分离的样品的最大分子量。 一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二 醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意 的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形， 而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此工 作曲线会带来很大的误差。故最好以蛋白 质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作曲 线。
凝胶过滤色谱填料的种类和性能
用于凝胶色谱的填料主要是 用天然的多糖类原料制成的， 早 它们的机械强度低，粒径较 期 大而不均匀，很难在高流速 下流，费时、费力且分辨 率也很低。
理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能： 6.具有较高的孔径， 1.机械强度高，能耐受 以利于得到高分容量。 几兆帕的操作压力。 较高的化学稳定性， 2.7. 球形颗粒，粒子直径 控制在 3~10um，且粒 有较宽的适用 PH值 径分布窄，达到高柱效。 范围. 3.具有亲水性表面，以 8.有较好的生物相容 利降低疏水性效应。 4.性，不会引起生物活 非离子性，表面没有 性物质的失活和降解。 离子交换基团。 5.9. 孔径约为 5~100nm之 容易处理和充填。 间，以适应不同分子量 10.价格合理。 范围物质的分离只需。
凝胶过滤色谱填料
第三组
目录
凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 的 种 类 和 性 能 常 见 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料
概 述
凝 胶 过 滤 色 谱 分 离 原 理
凝 胶 色 谱 填 料 的 制 备
凝 胶 过 滤 色 谱 的 应 用
概述
体积排除色谱（SEC） 凝胶过滤色谱是体积排除色谱（ ）的一种。
！
由工作曲线可确定该凝胶过滤色 谱柱的分离范围，指的是工作曲 线线性部分所对应的分子量区间。
凝胶色谱填料的制备
• 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直 接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚 糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销 售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是 以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带 上亲水性基团。 • 制备方法如下：见书246 • 即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，以高孔隙度硅 胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型 化学键合硅胶。
凝胶过滤色谱的应用
• 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基 酸锌螯合物螯合率的差异性
采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两 种氨基酸锌螯合物的螯合率，发现该法测定结果与其他测 定方法分析结果一致，表明此法适用于测定蛋氨酸锌的螯 合率
但测定苏氨酸锌螯合物的螯合率时，测定结果与其他测定 方法分析结果不一致，结合葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定 过程，表明此法不适用于测定苏氨酸锌的螯合率。
凝胶过滤色谱的应用
• 例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase 的凝胶过 滤色谱复性
方法: 使用透析和凝胶色谱对Fibrolase 复性进行 研究, 比较2 种复性方法的相对复性率及蛋白质 回收率。结果: 2 种复性方法的复性率分别为 20%、25%, 蛋白质回收率分别为16%、5%。
结论:凝胶过滤色谱复性优于透析法复性, 凝胶过 滤色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行, 简 化了操作程序, 提高了产品回收率。
主要缺点：
分辨率及峰 容量均相对 较低。
凝胶过滤色谱的分离原理
◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱 如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁 中进。 流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的 ◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。 孔体积。这样，分子体积不同的混合物一起进 ①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中， 入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分 即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。 子先流出柱子，小分子量即体积小的分子印刻 ②分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的 进入凝胶的孔中，使其行程延长而滞后流出， 差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔； 从而使分子体积不同的分子得以分离。
世 纪 年 代 中 期
以可控孔径玻璃（CPG）、 硅胶为基质的无机基质高效 凝胶色谱填料和以合成高分 子或高交联天然高分子为基 质的有机高效凝胶色谱填料 相继问世，他们均基本上可 以满足上述要求。
20 70
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粒度及粒度分布
孔径或孔径分布 孔容
关系到凝胶色谱柱 因此，用作凝胶 的分离容量。根据 粒径及粒径分影响 分离介质的硅胶， 凝胶色谱柱的一般 其柱效 理论，孔容愈大， 必须具有较高的 所填装的柱子的分 例如，通常所使用 孔度。对于多空 辨率和柱子的容量 的直径 5um的软 硅胶而言， Ψ一 就愈高。因此，用 般在0.6~0.7， 胶，能达到理论塔 作凝胶分离介质的 故Vi/V 0值应在 板数 1500/m 左右 硅胶，必须具有较 1.05~1.23之间 的柱效 高的孔容。
常见凝胶过滤色谱填料
• 表11-8列出了常见的无机型亲水凝 胶，尽管牌号各异，但其化学本质 几乎均是二醇型化学键合硅胶。
！
见书本247页
凝胶过滤色谱的应用
• 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性
利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解 液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量 分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离 组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定 法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属 铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化 能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC 分离和氨基酸组成分析