第八章发酵产物的分离提取
第八章--发酵染菌及其防治全文编辑修改
2、发酵染菌的异常现象
（1）菌体浓度异常 菌体浓度异常下降 菌体浓度异常升高 菌体繁殖和代谢速率缓慢
（2）pH过高或过低 pH上升（感染噬菌体，导致菌体自溶，释放大量氨、 氮） pH下降（感染杂菌，基质大量消耗产生酸性物质）
（3）溶解氧及CO2水平异常 溶解氧短时间内下降，甚至接近零，且长时间不能 回升（污染耗氧微生物） 耗氧量减少，溶解氧升高（污染非耗氧微生物或者 噬菌体） 耗糖量加快，CO2含量增加（污染杂菌） 耗糖量减少，CO2含量减少（污染噬菌体）
第一节 染菌对发酵的影响
一、染菌对发酵过程的影响
生产不同的品种，可污染不同种类和性质的微生物。 不同污染时间，不同污染途径，污染不同菌量，不同培 养基和培养条件又可产生不同后果
1、发酵染菌对不同发酵品种的影响
（1）不同生产菌可能污染的染菌 ➢放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多 ➢霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。
酚红肉汤培养基检测（检查培养基和无菌空气是否染菌， 肉汤由红变黄） 平板划线 显微镜观察
3、检查的工序和时间
工序 斜面 摇瓶种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 种子罐种子 发酵 发酵 发酵 发酵 发酵 总过滤器 分过滤器
表1 发酵过程的杂菌检查
时间
0h 0h 培养中期 成熟种子 0h 0h 8h 16h 24h 每月一次 每月一次
第八章 发酵染菌及其防治
发酵染菌（contamination）：发酵培养过程中除了生产菌 以外，侵入了有碍生产的其它微生物。
发酵染菌的危害 ➢发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致 命伤。 ➢造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失 ➢扰乱生产秩序，破坏生产计划。 ➢遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的 情绪和生产积极性。 ➢影响产品外观及内在质量
第八章_发酵过程参数的检测及控制
主要参数检测原理及仪器
•液体和气体流量测定
主要参数检测原理及仪器
• 搅拌转速
常用检测方法：磁感应式、光感应式和测速发电机等。
感应片切割磁 场或光速。
输出电压与转 速成正比。
主要参数检测原理及仪器
• pH的检测
常用pH检定仪为复合pH电极，具有
结构紧凑，可蒸汽加热灭菌的优点。
思考：pH电极如何标定？
③自适应控制：
提取有关输入、输出信息，对模型和
参数不断进行辩识，使模型逐渐完善；同
时自动修改控制器的动作，适应实际过 程。——自适应控制系统。
2、发酵自动控制系统的硬件组成
传感器 变送器 执行机构
电磁阀、气动控制阀、电动调节阀、变速电机、 正位移泵、蠕动泵。
转换器 过程接口 监控计算机
（一）温度的控制
生长阶段
生成阶段
自溶阶段
2、引起pH下降的因素
碳源过量 消泡油添加过量 生理酸性物质的存在
3、引起pH上升的因素
氮源过多
生理碱性物质的存在 中间补料，碱性物质添加过多
4、 pH的控制
调节基础培养基的配方
调节碳氮比（C/N）
添加缓冲剂 补料控制 – 直接加酸加碱 – 补加碳源或氮源
1、基本的自动控制系统
②反馈控制 反馈控制是自动控制的主要方式
控制器
被控对象
传感器
1、基本的自动控制系统
②反馈控制
开关控制：控制阀门的全开全关；
PID控制：采用比例、积分、微分控制算法；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ串联反馈控制：
两个以上控制器对一变量实施联合控制；
前馈/反馈控制：
前馈控制与反馈控制相结合。
发酵工程原理与技术_陈坚_思考题
发酵工程原理与技术_陈坚_思考题第一章的复习思考题1，发酵及发酵工程的定义2，发酵工程的特点3，发酵的分类4，发酵产品的类型5，微生物代谢产物的类型及其之间的关系6，发酵过程的组成7，发酵生产成立的条件8，发酵工业发展的阶段及大致年代9，和国际先进水平相比较，我国发酵工业的不足之处主要表现在哪些方面第二章的复习思考题1，微生物代谢调节和微生物代谢调控的概念2，为何要进行微生物的代谢调控3，微生物代谢调节的方式4，从本质上来说，微生物的代谢是通过哪两种方式来进行的5，酶合成调节的方式及其定义、机制6，酶活性调节的定义、方式7，有分支代谢途径的调节方式有哪些8，酶活性的调节机制可用什么理论来解释9，初级代谢的调节有哪几种方式10，次级代谢的调节方式11，提高初级和次级代谢产物产量的方法12，高浓度细胞培养的目的、原理、优点、方法及存在的问题第三章的复习思考题1，次级代谢和次级代谢产物的概念2，次级代谢产物的分类3，次级代谢产物的生物合成模式4，在微生物的氢代谢过程中，关键的酶是什么酶，它有哪些类型5，氢效应的概念及产生的原因6，二氧化碳固定的概念、方式、生理意义7，什么是卡尔文循环，它由哪几个部分组成第四章的复习思考题1，原料的定义及选择原则2，培养基设计的基本原则及如何进行培养基的设计3，为何要进行原料预处理及原料预处理的方法4，原料粉碎的目的和方法5，垂式粉碎机生产能力的计算6，干法粉碎和湿法粉碎工艺的比较7，原料输送的方法8，气流输送的原理、流程和优点9，颗粒在垂直管道和水平管道中悬浮输送的机理10，气流输送中常用除尘装置有哪几种11，淀粉原料水-热处理的定义及目的12，淀粉的膨胀、糊化和液化13，在淀粉的水-热处理过程中有哪些反应（变化）是我们所不希望的14，淀粉的酶法液化和糖化工艺常用到的酶有哪些及各自的作用专一性15，酶法液化的工艺有哪几种及各自的优缺点16，淀粉液化效果的标准17，淀粉糖化的定义和目的18，淀粉糖化的理论收率、实际收率和淀粉转化率的定义及计算19，DE值的定义20，淀粉糖化的工艺有哪几种，比较各自的优缺点21，糖蜜原料的来源、特点及常用的处理方法22，在发酵培养基中添加前提物质、抑制剂和促进剂为何能提高产物的产量第五章的复习思考题1，何谓培养基的灭菌，它和消毒有和区别2，常用的灭菌方法3，致死温度、微生物热阻的定义4，湿热灭菌的原理和优点5，从工程角度看，设计一个培养基的湿热灭菌过程首先要解决的问题是什么6，根据微生物的热死灭动力学方程和温度对微生物热死灭常熟（K）的影响，论述为什么采用高温短时间灭菌既有利于杀灭微生物又有利于减少营养物质的破坏7，间歇灭菌的成功的要素及注意事项8，常用的连续灭菌工艺有哪几种9，连续灭菌和间歇灭菌的比较10，影响灭菌的因素第六章的复习思考题1，何谓无菌空气，发酵工业对空气无菌程度的要求2，空气含菌量的测定方法3，空气除菌的方法有哪些、这些方法的原理和优缺点4，介质过滤除菌的定义，机理；过滤介质的类型5，常见的空气过滤除菌工艺流程的分析计算6，过滤效率、对数穿透律7，传统空气过滤除菌工艺中的主要设备有哪些8，新型的空气过滤器有哪些，有何优点9，空气贮罐的作用是什么，其大小如何确定第七章的复习思考题1，种子的扩大培养的定义。
第八章 生物产品的萃取和富集
图1 连续错流萃取回收酶的流程图
目的产物的萃取
细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机 盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过 选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配 到上相( PEG相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂 蛋白等分配到下相(富盐相) 。主要原因有： (1) 核酸和多糖由于其亲水性，易分配到富盐相， 目标蛋白质只有分配到富PEG相才能达到分离目 的。 (2) 下相的高盐浓度易造成蛋白质失活或沉淀，而 PEG对蛋白质有保护作用。 (3) 细胞碎片分配在下相有利于连续式离心机分离， 如在上相易堵塞离心机出口。
第1步萃取后的上相中还含有较多杂蛋白及一些 核酸、多糖和色素(色素因其疏水性分配在上相) 等，可通过加入适量的盐，再次形成PEG/无机盐 体系来进行纯化。目标蛋白质仍留在PEG相中。 在第3步萃取中则将蛋白质转入富盐相，从而将 蛋白质与PEG分离开。但从经济角度考虑，一般 用2步萃取，即在第2步将目标蛋白质转入富盐相。
含水量是反胶团的一个重要参数，决定反胶团物 理性质，决定其大小和每个胶团中所含表面活性 剂的个数。 含水量与表面活性剂的种类、助表面活性剂、水 相中盐的种类和浓度有关。
反胶团体系分类
反胶团制备
相转移法
注射法 溶解法
溶解推动力
A 静电作用： 当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引 力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数 较大,反之,则不能溶解到反胶团相中. B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0 随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排 阻作用增大, pro溶解下降.
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间 的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作 用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相 互作用的和。
发酵产物的分离提取—沉淀与离心
温度
pH
操作方式
有机溶剂法——利用酶蛋白在有机溶液中的溶解度不同，使目的酶
蛋白和其他杂蛋白分开，并浓缩，故此法可以使酶分级提纯。
有机溶剂的种类和用量
温度
影响有机溶剂
提取酶的因素
pH
中性盐浓度
时间
二、 离心
作用：液-液、固-液、液-液-固分离的常用手段
离心沉降
离心分离
离心过滤
（一）离心沉降原理
球形粒子沉降：
盐析法
（1）定义
在高浓度中性盐存在的情况下，随着中性盐的浓度增加，
欲分离蛋白质在水溶液中的溶解度会降低并沉淀析出的现象。
（2）盐析法机理
（1）盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的
有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，
导致蛋白质溶解度下降。
（2）盐离子电荷的中和作用，静电斥力降低，使蛋白质的溶解度
2
式中： ω——旋转角速度，rad/s
r——粒子离转轴中心的距离
ω2 2 2
=
=
≈
900
f——离心分离因数
f<3000
常速离心机
f=30000-50000
中速离心机
f>50000
ห้องสมุดไป่ตู้
高速离心
f>2×105
超高速离心机
（二） 离心沉降设备
① 瓶式离心机
② 管式离心机
③ 多室式离心机
下降。
（3）盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子极化，
使水活度降低。
（3）影响因素
无机盐的加入量
蛋白质的浓度
影响盐析的各种因素
第八章产物的分离和纯化
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3. 凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细 胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚 结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外， 还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤 液质量。因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用 的预处理方法之一。常用于菌体细小而且粘度 大的发酵液的预处理。
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• 工业上常用的过滤分离设备有板框压 滤机、膜过滤机和离心沉降分离机等。
• 这些过滤装置各有其优缺点，根据不 同产品的具体实际加以选择。
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6 其它方法
• 1. 高 价 无 机 离 子 的 去 除 （ Ca2+ 、 Mg2+ 、 Fe2+等）
6/4溶/202液4 称为萃取液。
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• 工业上萃取的操作包括三个步骤：
• 一是混合
• 将料液和萃取剂充分混合形成乳浊液， 让溶质自料液转入萃取剂中，此过程通常 在搅拌罐中进行，也可以在很高速度的管 道内混合。
例如：在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化
钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白 质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而 除去，从而可加快过滤速率。
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③变性法
蛋白质由有规则的排列到无规则结构的变化过程成为变性。变 性的蛋白溶解性小。
使蛋白质变性的方法有：加热，大幅度调节pH，加酒精等有机 溶剂或表面活性剂等 。
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2
• 2)、培养液是复杂的多相分散体系：
•
是多相体系，一般情况下，分散介质是水。
分散在其中的固体和胶体物质组成复杂，不仅
发酵产物的分离提取—蒸发、结晶与干燥
（二）结晶设备的结构及特点
按照形成过饱 和溶液的途径 不同分
冷却结晶器 蒸发结晶器
真空式结晶器
1. 冷却结晶器
槽式连续结晶罐
结晶罐
2. 蒸发结晶器
3. 真空式结晶器
三、 干燥
干燥： 从物体中除去水分的操作。
目的： 防止变质，便于储存和运输
（一） 干燥原理 分类：
二、 结晶
结晶：物质自溶液中成晶体状态析出，或从熔融状态受冷凝结 成晶的过程。
起晶方法
自然起晶：将溶液用蒸发浓缩的方法排除大量溶剂，
使溶液浓度进入过饱和不稳定区
刺激起晶：用蒸发浓缩的方法使溶液浓度进入过饱和
介稳定区，使溶液受到突然冷却，进入不稳定区。
晶种起晶：将溶液浓缩到介稳定区的饱和浓度后，加入
第六节 蒸发、结晶与干燥
蒸发操作的目的：
获得浓缩的溶液，直接作为产品或半成品。 通过蒸发操作获得过饱和状态，随后加以冷却，析出 固体产物，即采用蒸发，结晶的联合操作以获得固体溶质。 除杂质，获得纯净的溶剂。
（一） 蒸发原理
蒸发是溶液浓缩的单元操作。它采用加热的方法，使溶有不挥发性 溶质的溶液沸腾，其中的部分溶剂被气化除去，而溶液得到浓缩。
结合方式
化学结合水 物化结合水
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
除水难易
非结合水
机械结合水
结合水
实质：在不沸腾的状态下用加热汽化的方法驱除湿物料中所含液态水分的过程
（二） 干燥设备
1. 气流干燥
热风炉
2. 喷雾干燥
3. 沸腾干燥
常压蒸发（麦芽汁煮沸锅）
蒸发方法
减压或真空蒸发
真空蒸发设备的优点：
发酵工程下游加工工程
• （二）清除高价无机离子 • 1. Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂旳互换容量 • 2. 用草酸清除钙离子，草酸钙还能增进蛋 • 白质凝固 • 3. 三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物 • Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ • 4. 黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀
• 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+
• （三）清除可溶性杂蛋白 • 1. 蛋白质等电点沉淀 • 两性物质，稳定性与所带电荷有关 • 酸性溶液中带正电荷，碱性中带负电荷 • 2. 酸性溶液中与阴离子物质结合形成沉淀 • 三氯醋酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味 • 酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等 • 3. 碱性溶液中与阳离子形成沉淀 • Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等
时，可同步清除非活性蛋白质
• 二. 发酵液固液分离 • （一）离心 • （二）过滤 • 菌种对过滤速度影响很大 • 真菌轻易过滤，放线菌则难 • 培养基构成对过滤也有影响
• 第三节 微生物细胞破碎
• 一. 微生物细胞壁旳构成与构造 • 微生物种类，培养基构成影响细胞壁 • 二. 常用细胞破碎措施 • 1. 珠磨法（bead mill） • 试验室：Mickle捣碎机、匀浆器Braun • 中试：胶质膜处理 • 工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）
• 4. 盐析 • 亲水胶体，加入碱金属中性盐，脱水剂 • 5. 热变性 • 一般蛋白质在70~80C发生不可逆变性 • 如链霉素发酵液在pH3.0，加热到70 C保 • 持0.5h后过滤 • 柠檬酸发酵液在80 C处理 • 6. 加入絮凝剂 • 7. 吸附作用
发酵产物的分离提取
球磨机
原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微 球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮 液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套 带走。
②影响细胞破碎的因素
a.珠体的大小
实验室规模，珠径0.2mm，工业 规模珠径大于0.4mm
➢ b.珠体的装量
80～90％
c.搅拌速度
三、发酵产物分离的过程选择
发酵产品后处理过程流程图
第二节 细胞破碎
细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定 程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地 释放到液相中。
细胞破碎机理图
细胞破碎的阻力
➢细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状 结构越致密，破碎的难度越大；
➢酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧 密程度和它的厚度；
➢ 转鼓形状：圆筒形：有利于液相澄清
➢
圆锥形：有利于固相脱水
➢
圆筒+圆锥形：有两者的优点，应用最广
2、螺旋
➢ 螺旋推进器与转鼓的转差率：1：100 ➢ 转差率越小，物料在转鼓内停留的时间越长，排渣慢，滤渣较干 ➢ 转差率越大，物料在转鼓内停留的时间越短，排渣块，滤渣较湿 ➢ 转差率为零，不排料
3、差速器
适当
d.操作温度
5～40℃
e.被处理细胞的特性
珠磨法的破碎率一般控制在80％以下
超声破碎法（Ultra-sonication）
超生波破碎细胞时的频率一般为15～20 kHz，功率 为100～250W，可分为槽式和探头直接插入介质式 两种型式。
其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。
影响超生波破碎的因素
45～50
1～13
发酵工程填空题(可编辑修改word版)
一・填空题S.三种类型。
4. （发酵工程）是连接生物技术上下游过程的重要枢纽：（发酵工程〉是生物技术产业化的一个主要途 径。
5. 发酵丄程发展史可分为三个发酵技术阶段：在1910以前为（自然）发酵技术阶段；深层培养生产青 霉素属于（近代）发酵技术阶段：现代生物技术的技术特征就是以（基因工程〉为首要标出。
K 常川工业微生物可分为：｛细菌人酵卽歯、霉菌、（放线菌）W 大类。
2. 在培养基中掺入可溶性淀粉.酩素或CaCOS 可以分别用于检测菌株产（淀粉）陈产｛蛋白）酶或产（酸） 能力的大小。
（自然选S ）是指对自然界中的微生物（未经人工诱变或杂交处理的悟况下）进行分离和纯化・择优选取微生物菌种的方法。
4. 工业微生物育•种的基木方法包括自然选育、（诱变S 种人代谢控制育种、（S 因S 组）和定向冇种等: 原生质体融合技术.基W 工程技术而进行的诱变育种称为（杂交育种九5. 由于自发突变的作用而引起某些优良特性变觀或消失的现彖称｛菌种《退）。
6. 常用菌种保藏方法有（斜面）、沙上管、（液体石蜡）、真空冷冻等保藏法等。
（自然选S ）方法简易行，但茯斜优良菌种的几率小.一股难以满足生产的需要。
获須纯培养的方法有（稀释法）、划线法、（单细胞）挑选法、选择培养基分离法等方法。
富集培养目的就是让（目的菌）在种群中占优势.使筛选变得可能。
工业微生物凿种可以來自（自然分离人也可以來自从微生物菌种保藏机构与（工业单位）获取。
从自热界（获得目的菌的）分离利筛选微生物菌种，一股分为采样.（富集培养入纯种分离、（初 筛和复筛＞等步骤。
12.（透明圈）法在固体培养基中渗入济解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培 养基背景，所筛选的菌落周m 就会形成透明圈.（变色圈）法在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出來。
（生长圈）法将待检菌涂布于含工具菌并缺少工具歯营养物的平板上培养.若能合成平板工具茵所 需的营养物，在该菌株的菌落周鬧工具歯便会形成一个混浊的生长圈。
生化分离工程知识点总结归纳
生化分离工程知识点归纳第一章绪论1、生物物质分离工程：在工业规模上，通过适当的分离纯化技术与装备并消耗一定的能量和分离介质来实现生物物质（产品）制备的过程，是生物产业的一个重要组成部分。
2、生物工程下游加工过程的特点：（1）成分复杂：固体成分、液体成分（2）悬液中的目标产物浓度低（3）稳定性差：化学（温度和pH值）或微生物引起的降解（4）生物产品质量要求高：纯度、卫生、生物活性3、下游加工过程的一般流程（4个阶段）：发酵液的预处理与固液分离、初步纯化（提取）、高度纯化（精制）、成品加工。
4、某一具体产品的分离提取工艺设计中应考虑的问题：①产物本身的性质；②是胞内产物还是胞外产物；③原料中产物和主要杂质浓度；④产物和主要杂质的理化特性及差异；⑤产品用途和质量标准；⑥产品的市场价格；⑦不同分离方法的技术经济比较及废液的处理方法等。
第二章发酵液的预处理与过滤1、发酵液的预处理发酵液的预处理的方法：（1）加热：最简单、最经济的预处理方法是加热，降低料液黏度，也可以对其进行灭菌。
但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。
（2）调节料液的pH值：促进全细胞聚集。
（3）凝聚和絮凝：凝聚是指通过加入简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒，粒子的密度越大，越易分离。
常用凝聚剂多为阳离子型如明矾、三氯化铁。
絮凝是指预处理时加入絮凝剂（通常指天然或合成的生物大分子聚电解质）既能降低排斥电位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶粒形成粗大，密度低的絮凝团。
这些絮凝团很容易被过滤得到。
主要絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、多聚胺衍生物。
（4）使用惰性助滤剂：硅藻土、珍珠岩。
2、真空过滤器的优点：连续自动操作,节省人力，生产能力大。
真空过滤器的缺点：附属设备多，投资费用高，推动力小适用于量大易过滤的料液。
3、压滤器的优点：过滤推动力大，过滤面积大。
压滤器的：缺点：板框压滤机劳动强度大，投资、维护费用高。
发酵重点1-8
1、发酵工程的基本定义？发酵工程：是利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分。
发酵工程也称作微生物工程，该技术体系主要包括菌株选育与保藏、菌种的扩大生产、微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化制备，同时也包括微生物生理功能的工业化利用。
2、提出研发一个发酵新产品的可能路线发酵生产工艺流程除某些转化过程外，典型的发酵工艺过程大致可以划分为以下6个基本过程①用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；②培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；③扩大培养有活性的适量纯种，以一定比例将菌种接入发酵罐中；④控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；⑤将产物提取并精制，以得到合格的产品；⑥ 回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。
3、发酵工业的特点①常温常压下进行的生物化学反应，条件较温和②较廉价的原料生产较高价值的产品③通过生物体的自适应调节来完成，反应专一性强，可以得到较为单一的代谢产物④可以产生比较复杂的高分子化合物⑤不受地理、气候、季节等自然条件的限制，可以根据订单安排通用发酵设备来生产多种多样的发酵产品1、为什么需要进行微生物菌种改良？①提高目标产物的产量生产效率和效益！②提高目标产物的纯度，减少副产物可有效降低产物分离成本。
③改良菌种性状，改善发酵过程改变和扩大菌种所利用的原料范围、提高菌种生长速率、保持菌株生产性状稳定、提高斜面孢子产量、改善对氧的摄取条件并降低需氧量及能耗、增强耐不良环境的能力（如耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的过量代谢产物）、改善细胞透性以提高产物的分泌能力等。
④改变生物合成途径，以获得高产的新产品2、你认为菌种筛选过程中最关键的环节是什么？筛选方法（1）平皿快速检测法肉眼可观察的变化。
显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法…（2）形态变异的利用（3）高通量筛选(high throughput screening)3、如果尽量保持菌种不发生退化？（1）控制传代次数基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。
第八章发酵下游过程
大多数发酵产品的下游加工过程， 常常按生产过程的顺序分为四个大框 架步骤，即发酵液的预处理和过滤、 提取、精制、成品加工
下游加工的一般流程
• 第一节 下游加工过程及技术
• 一、发酵液的预处理和固液分离
• 细胞外产物：酸化、加热、加絮凝剂等
• 细胞内产物：酸化、加热、加絮凝剂等，外加细胞破碎。
• 细胞破碎方法：物理法→高压匀浆机、球磨机、超声波 等
•
化学法→加酸或碱处理• Nhomakorabea生物法→用酶处理
• 固液分离：过滤和离心
• 二、初步纯化（提取）
• 1.吸附法：活性炭、白土、氧化铝等
• 2.离子交换法：阴离子或阳离子交换树脂
• 3.沉淀法： ①盐析法
•
②有机溶剂沉淀法
•
③等电点沉淀法
•
④非离子型聚合物沉淀法
• 2.无菌过滤和去热原
• 3.干燥
•
⑤聚电解质沉淀法
• 4.溶剂萃取法：用于抗生素等小分子物质提取
• 5.双水相萃取 • 6.超临界萃取 • 7.超滤法
• 三、高度纯化（精制）
• 1.层析法
• 2.结晶：调节pH值，改变溶解平衡，产物析出；
•
溶液冷却或加入其他溶剂或将溶剂蒸发；
•
加入晶种，有利于加快产物析出
• 四、成品加工
• 1.浓缩
发酵产物的分离提取—离子交换与吸附
树脂的网络骨架：
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谢谢
活 性 炭 吸 附 柱
离子交换剂
一、离子交换剂的种类
无机离子交换剂 • 天然沸石：交换容量小，使用pH值范围窄 • 高价金属磷酸盐、高价金属水合氧化物
有机离子交换剂 • 离子交换树脂
目前用的最多的是人工合成的有机高分子， 聚合物的离子交换剂——离子交换树脂
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二、离子交换树脂
固体球形颗粒，多孔网状结 构；不溶于水；具有离子交
苯乙烯(单体) +
二乙烯苯(交联剂)
换特性的有机高分子聚电解 质。
母体（骨架）
共聚
母体
功 能 H2SO4 基 反 应
离子 交换
固定离子 R —SO3 H
树脂
活性基团
母体 固定离子 可交换离子
可交换离子
离子交换树脂的结构：
骨架：接有功能基团，本身是惰性
功能基团：连接在骨架上，可与相 反离子结合
可交换离子：与功能基团所带电荷 相反的可移动离子
吸 附
离子交换吸附
化学吸附 化学键
吸附作用力 选择性
所需活化能 吸附层
达到平衡所需时间
物理吸附 分子间引力
较差 低
单层或多层 快
化学吸附 化学键合力
较高 高
单层 慢
（一） 吸附剂的种类 1. 疏水或非极性吸附剂
代表： 活性炭 缺点： 选择性差
活性炭细孔分布及作用图
2. 亲水或极性吸附剂
代表： 硅胶、氧化铝、活性土等
3. 离子交换树脂吸附剂
作用： 脱色和分离杂质
（二） 吸附操作原理及设备
吸附操作
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三柱塞泵
往复泵
双 作 用 泵 工 作 原 理
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
温度
不宜采用高压匀浆法的微生物：
➢ 易造成堵塞的团状或丝状真菌， ➢ 较小的革兰氏阳性菌， ➢ 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀
高压匀浆器
均质头的结构
均质头的结构
大多数均质机上配备双级均质阀，在第一级中，料液 压力为19.6-25.4MPa, 主要使脂肪球破碎，第二级料 液压力减为3.43MPa, 主要使脂肪球均匀分散。阀和 阀座采用耐磨合金钢制造。三柱塞泵的特点是排液量 比较均匀。
➢ 传动采用二级变速，利用曲臂镶入一对人字齿轮，实 施对称传动，具有结构紧凑，弯矩小，受力均匀，平
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破 碎。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷 脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、 吐温等也可使细胞破碎。
2.化学破碎（Chemical permeation）
酶溶法
外加酶法 自溶法
化学试剂破碎法
表面活性物质 EDTA螯合剂 有机溶剂 变性剂
（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）
①外加酶法
G+ 溶菌酶、适量抑制剂
常
G-
溶菌酶、EDTA
用
放线菌 溶菌酶
的 溶
酵母菌 β-葡聚糖酶
酶
霉菌 几丁质酶、
➢ 酶法和化学法溶解细胞影响因素： 组成 结构
高压匀浆法(High-pressure homogenization) ——大规模细胞破碎的常用方法
原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙 高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到 静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这 一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压 的变化，从而造成细胞破碎。
浆阀）
适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。
珠磨法（Bead mill）
工作原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、 氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研 磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细 胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子 被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎 中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。
球磨机
原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微 球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮 液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套 带走。
②影响细胞破碎的因素
a.珠体的大小
实验室规模，珠径0.2mm，工业 规模珠径大于0.4mm
➢ b.珠体的装量
80～90％
c.搅拌速度
用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的 大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游 离的氨基酸。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性 剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择 地渗透出来。
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与 组成。
表面活性剂
植物 纤维素酶、半纤维素酶
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外 形完整。
酶溶法的缺点：
溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖 抑制葡聚糖酶。
（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）
机械力等敏感，不适宜条件下易失活或分解。
提取和精制
提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量 标淮要求的发酵成品。
发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同 ，分离纯化步骤有所不同。
但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离 、提取、精制、成品加工。
二、常用的分离技术及机制
➢ p267
➢声强、 ➢频率、 ➢破碎时间、 ➢介质的离子强度、 ➢pH ➢菌体的浓度和种类。
一般杆菌比球菌易破碎ห้องสมุดไป่ตู้G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母
菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20％左右。
渗透压冲击法（Osmotic pressure） 反复冻融法 干燥法
X-press法
此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体， 利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变 形而破碎。该法主要用于实验室，具有使用范围广、破 碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。 不适用于对冷冻敏感的物质。
三、发酵产物分离的过程选择
发酵产品后处理过程流程图
第二节 细胞破碎
细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定 程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地 释放到液相中。
细胞破碎机理图
细胞破碎的阻力
➢细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状 结构越致密，破碎的难度越大；
➢酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧 密程度和它的厚度；
适当
d.操作温度
5～40℃
e.被处理细胞的特性
珠磨法的破碎率一般控制在80％以下
超声破碎法（Ultra-sonication）
超生波破碎细胞时的频率一般为15～20 kHz，功率 为100～250W，可分为槽式和探头直接插入介质式 两种型式。
其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。
影响超生波破碎的因素
➢霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构；
➢成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁。
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪 切作用
液体剪 切作用
干燥 处理
溶胞 作用
高压 珠磨法 压榨 匀浆
超声 破碎
酶溶法 化学法 物理法
图8.2 细胞破碎方法分类
细胞的破影响因素
➢ 物理破碎时影响因素： 细胞的大小 形状 细胞壁的厚度 聚合物的交联程度
第八章 发酵产物的分离提取
第一节 发酵产物分离的特点与过程设计
一、发酵液的一般特性 （1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。 （2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代
谢副产物、残留培养基、无机盐等。 （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。 （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、