第八章发酵产物的分离提取

适当
d.操作温度
5～40℃
e.被处理细胞的特性
珠磨法的破碎率一般控制在80％以下
超声破碎法（Ultra-sonication）
超生波破碎细胞时的频率一般为15～20 kHz，功率 为100～250W，可分为槽式和探头直接插入介质式 两种型式。
其原理可能与空穴现象引起的冲击波和剪切作用有关。
影响超生波破碎的因素
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破 碎。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷 脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、 吐温等也可使细胞破碎。
高压匀浆器
均质头的结构
均质头的结构
大多数均质机上配备双级均质阀，在第一级中，料液 压力为19.6-25.4MPa, 主要使脂肪球破碎，第二级料 液压力减为3.43MPa, 主要使脂肪球均匀分散。阀和 阀座采用耐磨合金钢制造。三柱塞泵的特点是排液量 比较均匀。
➢ 传动采用二级变速，利用曲臂镶入一对人字齿轮，实 施对称传动，具有结构紧凑，弯矩小，受力均匀，平
三、发酵产物分离的过程选择
发酵产品后处理过程流程图
第二节 细胞破碎
细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定 程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地 释放到液相中。
细胞破碎机理图
细胞破碎的阻力
➢细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状 结构越致密，破碎的难度越大；
➢酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧 密程度和它的厚度；
植物 纤维素酶、半纤维素酶
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外 形完整。
酶溶法的缺点：
溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖 抑制葡聚糖酶。
（2）化学试剂破碎法（Chemical permeation）
浆阀）
适用于：微生物细胞和植物细胞的大规模破碎。
珠磨法（Bead mill）
工作原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、 氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研 磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细 胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子 被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎 中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。
➢声强、 ➢频率、 ➢破碎时间、 ➢介质的离子强度、 ➢pH ➢菌体的浓度和种类。
一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母
菌的效果较差。超声破碎时细胞浓度一般在20％左右。
渗透压冲击法（Osmotic pressure） 反复冻融法 干燥法
X-press法
此法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体， 利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔挤出，由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变 形而破碎。该法主要用于实验室，具有使用范围广、破 碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点。 不适用于对冷冻敏感的物质。
机械力等敏感，不适宜条件下易失活或分解。
提取和精制
提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度的、符合质量 标淮要求的发酵成品。
发酵产物存在形式不同，用途各异，产品质量要求不同 ，分离纯化步骤有所不同。
但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处理和菌体分离 、提取、精制、成品加工。
二、常用的分离技术及机制
➢ p267
第八章 发酵产物的分离提取
第一节 发酵产物分离的特点与过程设计
一、发酵液的一般特性 （1）发酵产物浓度较低，属于稀水溶液系统。 （2）成分复杂，含有目的产物、微生物细胞碎片、其他代
谢副产物、残留培养基、无机盐等。 （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有机杂质。 （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、有机溶剂、酶、
➢ 酶法和化学法溶解细胞影响因素： 组成 结构
高压匀浆法(High-pressure homogenization) ——大规模细胞破碎的常用方法
原理：细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙 高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到 静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这 一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压 的变化，从而造成细胞破碎。
2.化学破碎（Chemical permeation）
酶溶法
外加酶法 自溶法
化学试剂破碎法
表面活性物质 EDTA螯合剂 有机溶剂 变性剂
（1）酶溶法（Enzymatic Lysis）
①外加酶法
G+ 溶菌酶、适量抑制剂
常
G-
溶菌酶、EDTA
用
放线菌 溶菌酶
的 溶
酵母菌 β-葡聚糖酶
酶
霉菌 几丁质酶、
球磨机
原理：在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和微 球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮 液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。产热由夹套 带走。
②影响细胞破碎的因素
a.珠体的大小
实验室规模，珠径0.2mm，工业 规模珠径大于0.4mm
➢ b.珠体的装量
80～90％
c.搅拌速度
稳、低噪声等。
三柱塞泵
往复泵
双 作 用 泵 工 作 原 理
高压匀浆法中影响细胞破碎的因素:
压力 (工业生产中常用55～70MPa的压力) 循环操作次数(多次循环的操作方法)
温度
不宜采用高压匀浆法的微生物：
➢ 易造成堵塞的团状或丝状真菌， ➢ 较小的革兰氏阳性菌， ➢ 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀
➢霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构；
➢成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁。
破碎方式
Hale Waihona Puke Baidu
机械法
非机械法
固体剪 切作用
液体剪 切作用
干燥 处理
溶胞 作用
高压 珠磨法 压榨 匀浆
超声 破碎
酶溶法 化学法 物理法
图8.2 细胞破碎方法分类
细胞的破影响因素
➢ 物理破碎时影响因素： 细胞的大小 形状 细胞壁的厚度 聚合物的交联程度
用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的 大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游 离的氨基酸。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性 剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择 地渗透出来。
该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与 组成。
表面活性剂