有关物质方法开发及验证

有关物质方法开发以及验证

有关物质方法开发流程（主要针对仿制药）：

1.有关物质条件的选择：查询或者购买开发品种的国内外质量标准，有进口的

得到进口注册标准，找到国内代表性企业的质量标准（主要是首仿厂家和最新批准厂家的质量标准），比较这些标准，绝大多数情况下可以筛选出理想的检测条件。筛选过程一般以相同浓度样品进行，得到以下结果：

波长的选择：有关物质检测主要是考虑所有杂质的检出情况，因此，应全盘关注杂质的检测波长，可以采用已知杂质UV扫描和对未知杂质的DAD扫描得出较好的检测波长，切记不能只考虑主成分的最大吸收。

2.系统适应性

系统适应性主要考察杂质与主峰、杂质与杂质的分离情况，一般要求杂质与主峰或者已知杂质与杂质之间的分离度不小于1.5，未知杂质与未知杂质之间的分离度不小于1.2，同时关注拖尾因子与理论塔板数等信息。

通常采用在被测物对照品（或者供试品）中加入适量的杂质或辅料，以检测分离情况。杂质加入量一般为被测物浓度的1%，以模拟被测物中杂质的存在状态。接收标准：每个成分6针相对标准偏差不大于5.0%，此数据也可作为精密度试验数据。

3.定量方法的选择

有关物质定量方法主要有杂质对照品法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种。在我国，峰面

积归一化法暂时还未能接受，毫无疑问，定量最精确的为杂质对照品发，但有些杂质对照品的获得极难，成本也很大，尤其是在订入质量标准中，无疑为以后产品的生产检测带来极大困难与成本的大幅增加；加校正因子的主成分自身对照法为杂质定量的合适方法，但要求计算校正因子，有时在进口标准或者国外药典标准中已有杂质校正因子，但为了验证自身实验条件或者实验环境的精确情况，一般重新再计算校正因子与已知校正因子进行对比，在正常情况下，自身计算的校正因子与已知的校正因子无明显差异为最佳情况，校正因子的计算要求采用不同的色谱柱在不同的液相系统多次计算求得平均值作为校正因子。校正因子的获得最常用的就是分别制备相同浓度的被测物与各杂质溶液，分别得到标准曲线，其斜率值即为相应的校正因子（f）。当f 为0.8~1.2时，可以采用不加校正因子的主成分自身对照法定量，若f≥1.2或≤0.8时，则应加入校正因子进行定量；不加校正因子的自身对照法操作简单，但要求其杂质响应与主峰一致。

4. 供试品溶液浓度的确定、检测限和定量限

供试品溶液的浓度应能有效检出相关杂质，但浓度太高会产生主峰严重拖尾、分裂、检测器和色谱柱过载等情况，若浓度太低，则不利于杂质检出。一般以检测限作为衡量指标，谢沐峰老师的一片文章提到主峰浓度应为检测限浓度的2000~5000倍，通常情况，我们做到主峰浓度不小于检测限浓度的10000倍。数据如下报告：

5. 强力破坏试验

破坏条件有酸、碱、高温、光照、氧化，为了确认杂质的来源，同时对比空白（酸、碱、过氧化氢）与未破坏样品。

强力破坏以两种状态进行：

溶液状态：热、酸及碱水解、氧化、光照

固体状态：高温、高湿和光照

破坏程度不宜太大，以产生20%左右杂质的条件为宜，在破坏试验过程中，最好采用二极管阵列检测器，便于检测各峰的峰纯度，同时应该注意物料平衡以及过氧化氢溶液的浓度不宜太大（否则很溶液损坏色谱柱）。下面采用一个表格说

破坏前DAD扫描结果

6.线性试验

在已知杂质定量中，通常将杂质限度设定为该杂质100%浓度，线性范围为10%~150%，可接受范围为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

考察样品在配制溶剂中的杂质与主成分的稳定性。配制供试品溶液，测定条件下放置，分别于0、2、4、6、8、12小时进样。考察项目见下表：

值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。

8.准确度

以回收率表示，有2种做法，其一为将杂质以1%浓度加入被测物溶液中，制备6份溶液，考察主峰与杂质之间的分离度和各物质的回收率，计算RSD；

其二为将杂质以（3*LOD，3*100%,3*150%）浓度加入供试品溶液中共9份溶液，计算回收率以及精密度。可接受标准：每个杂质回收率为80%~120%，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

9. 耐用性试验

分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。

报告数据以流速变化为例：