细胞生物学实验课-76页PPT资料
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《细胞生物学实验》课件
荧光染色实验
原理，实验步骤
细胞凋亡实验
1 原理
描述细胞凋亡的机制和原理
2 实验步骤
介绍如何进行细胞凋亡实验的步骤
结束语
总结课程内容，展望细胞生物学的未来研究方向。
《细胞生物学实验》PPT 课件
细胞生物学实验PPT课件大胞质、细胞核
细胞器的功能
线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体
细胞生命周期
1
细胞分裂
有丝分裂、减数分裂
2
细胞生长和增殖
细胞周期
细胞生物学实验
细胞培养实验
细胞培养介质的配制，细胞培养的基本操作
细胞敲除实验
原理，实验步骤
细胞----实验观察动物细胞和植物细胞PPT课件(初中科学)
圈等
气泡太多
视野中无 显微镜操作失误（如反光镜未对
关斑或视 好,光过强、过弱或无光，物镜未 野太暗等 对准通光孔,准焦螺旋调节过快）
重新撕几次，挑选较薄 的表皮进行实验
在老师帮助下，用镊子 展平洋葱表皮后，重新 制作装片
在老师帮助下，加滴红 墨水
重新盖盖玻片或重新 制作装片
重新按正确方法操作 显微镜
擦→滴→撕→展→盖→染
请排列上述操作步骤的先后顺序：
④②①③⑤⑥
1、在用显微镜视察细胞装片时，为使视野 内看到的细胞数目最多，应选用下列哪组镜 头（ ）
A.目镜5×、物镜10× B. 目镜10×、物镜10×
C.目镜5×、物镜40× D.目镜15×、物镜40×
2、为了使临时装片内不产生气泡或少产 生气泡，盖盖玻片时应该（ ）
第2节 细胞
——视察动物细胞
和 植物细胞
显微镜的使用步 骤
安置
对光
放片
调焦
视察
一、安置
（1）右手握、左手托、略偏左
二、对光
（1）对物镜（2）对遮光器（3）对反光镜
三、放片
玻片放在载物台上，压片，正对通光孔
四、调焦
（1）眼看物镜 ，镜筒降落，直到接近玻片 （2）左眼凝视目镜，镜筒慢慢上升，直到看清物像
五、视察
视察到的是放大的倒像
e
临时装片的制作
实验器材：
显微镜，载玻片，盖玻片，滴管，镊子，吸水纸。
实验材料：
清水，红墨水/碘液，洋葱鳞片。
步骤：擦--滴--撕--展--盖--染
制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片
• 用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 • 把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片
细胞生物学实验技术 PPT
• 单个细胞虽能生长繁殖, 但不如群体细胞能力强，
当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果
• 对细胞外基质仍有依存性
– 差异：失去原有组织结构和细胞形态， 分化减弱或 不明显
• 细胞外基质
– 存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分， 分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性 成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白 (纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要 为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控 作用。 – 这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结 构、调节组织的发生和细胞的生理活动。
• 贴附型细胞的分类
– 成纤维细胞型 – 上皮型细胞 – 游走细胞型 – 多型细胞型
• 成纤维细胞型
– 梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。 – 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织， 如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 – 凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。
– 上皮型细胞： • 扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动， 细胞很少单独行动。 • 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化 管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
• 游走细胞型：
– 散在生长，不连成片， 呈活跃游走或变形运 动，方向不规则。 – 此型细胞不稳定，有 时难以和其他细胞相 区别。
• 当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生 存期才可能发生改变。
• 生命周期的三个阶段
– 原代培养期 – 传代期 – 衰退期
原代培养（Primary Culture）期
• 原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养 到 第一次传代。
• 原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上 相似性大。 • 特点
当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果
• 对细胞外基质仍有依存性
– 差异：失去原有组织结构和细胞形态， 分化减弱或 不明显
• 细胞外基质
– 存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分， 分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性 成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白 (纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要 为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控 作用。 – 这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结 构、调节组织的发生和细胞的生理活动。
• 贴附型细胞的分类
– 成纤维细胞型 – 上皮型细胞 – 游走细胞型 – 多型细胞型
• 成纤维细胞型
– 梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。 – 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织， 如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 – 凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。
– 上皮型细胞： • 扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动， 细胞很少单独行动。 • 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化 管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
• 游走细胞型：
– 散在生长，不连成片， 呈活跃游走或变形运 动，方向不规则。 – 此型细胞不稳定，有 时难以和其他细胞相 区别。
• 当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生 存期才可能发生改变。
• 生命周期的三个阶段
– 原代培养期 – 传代期 – 衰退期
原代培养（Primary Culture）期
• 原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养 到 第一次传代。
• 原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上 相似性大。 • 特点
细胞生物学实验ppt课件
nuclei
28
四、作业
1．绘制口腔上皮细胞(点线绘图法) 2．低倍镜、高倍镜下测微尺的标定方法及结果 3．计算核质比
29
镜台测微尺
30
目镜测微尺（200小格）
31
实验二、细胞生理活 动的实验观察
32
实验目的
通过制片与观察加深理解细胞吞噬等生理活动 掌握死活细胞鉴别的原理及方法
许多酸性染料不易穿过活细胞的质 膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞 内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
8
9
(一)临时制片——口腔上皮细胞标本的制备
取载玻片一张(揩净)→加一滴生理盐水→取材(口腔内颊 部上皮细胞)→涂于生理盐水中→盖盖玻片→染色(甲基 蓝)1’→观察
10
(二)显微测量
1．显微测量计
目镜测微尺 镜台测微尺
11
(1) 目镜测微尺
1.外形是一圆形玻片，装入目镜镜筒中。 用于测量标本用。 2.刻度标记0~100，实际分为200等份，每一个格的长
度需用镜台测微尺标定。
12
(2) 镜台测微尺
1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的标尺。 2.总长度为1mm，分为100等份，每一个格的长度为
0.01mm(10μm)。
13
(3)标定方法
①将镜台测微尺置镜台上。 ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜测微尺平行且
左端对齐(0刻度重合)。
using of the microscope
(I) Use of low objective lens (II) Use of high objective lens
7
Structure of the microscope Mechanical part Optics part Lighting part
28
四、作业
1．绘制口腔上皮细胞(点线绘图法) 2．低倍镜、高倍镜下测微尺的标定方法及结果 3．计算核质比
29
镜台测微尺
30
目镜测微尺（200小格）
31
实验二、细胞生理活 动的实验观察
32
实验目的
通过制片与观察加深理解细胞吞噬等生理活动 掌握死活细胞鉴别的原理及方法
许多酸性染料不易穿过活细胞的质 膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞 内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
8
9
(一)临时制片——口腔上皮细胞标本的制备
取载玻片一张(揩净)→加一滴生理盐水→取材(口腔内颊 部上皮细胞)→涂于生理盐水中→盖盖玻片→染色(甲基 蓝)1’→观察
10
(二)显微测量
1．显微测量计
目镜测微尺 镜台测微尺
11
(1) 目镜测微尺
1.外形是一圆形玻片，装入目镜镜筒中。 用于测量标本用。 2.刻度标记0~100，实际分为200等份，每一个格的长
度需用镜台测微尺标定。
12
(2) 镜台测微尺
1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的标尺。 2.总长度为1mm，分为100等份，每一个格的长度为
0.01mm(10μm)。
13
(3)标定方法
①将镜台测微尺置镜台上。 ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜测微尺平行且
左端对齐(0刻度重合)。
using of the microscope
(I) Use of low objective lens (II) Use of high objective lens
7
Structure of the microscope Mechanical part Optics part Lighting part
《细胞生物学实验》PPT课件
35
备注
36
实验四 叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的：
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器 分离的一般原理和方法；
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟 悉荧光显微镜的使用方法。
37
二、 实验原理
组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是 分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降 速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以 及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一 时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依 次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中 的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。
53
实验内容与实施过程
4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） ①取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净； ②将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无 菌蒸馏水漂洗5次； ③用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养 皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
49
②原生质体分离纯化或融合后，在适当的 培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞 壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团， 长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其 中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体 培养中最基础也是最关键的环节。
50
三、实验仪器
台式离心机、 高压灭菌锅、 倒置显微镜、 超净工作台
26
③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒 体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧 化酶使染料保持氧化状态，即有色状态， 呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被 还原，成为无色状态
27
三、实验仪器
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、 双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖 玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
备注
36
实验四 叶绿体的分离与荧光观察
一、实验目的：
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器 分离的一般原理和方法；
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟 悉荧光显微镜的使用方法。
37
二、 实验原理
组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是 分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降 速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以 及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一 时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依 次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中 的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部， 分批收集即可获得各种亚细胞组分。
53
实验内容与实施过程
4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） ①取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净； ②将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无 菌蒸馏水漂洗5次； ③用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养 皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；
49
②原生质体分离纯化或融合后，在适当的 培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞 壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团， 长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其 中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体 培养中最基础也是最关键的环节。
50
三、实验仪器
台式离心机、 高压灭菌锅、 倒置显微镜、 超净工作台
26
③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒 体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧 化酶使染料保持氧化状态，即有色状态， 呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被 还原，成为无色状态
27
三、实验仪器
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、 双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖 玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
细胞生物学实验课
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细胞生物学实验课
一、实验目的
1. 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过 除菌法的操作。
2. 了解化学消毒法的使用方法。 3. 了解传代细胞的传代方法及操作过程，
学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况及细胞增殖动力学测定的方法。
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细胞生物学实验课
二、实验原理
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严 谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长， 必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所 必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、 维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、 适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调 节。二是严格控制无菌条件。
（1）配制100倍1L MS大量元素母液
NH4NO3 KNO3
165g 190g
KH3PO4
17g
CaCl2·2H2O 44g
MgSO4·7H2O 37g
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细胞生物学实验课
四、实验步骤
（2）配制MS微量元素母液
配制成100倍1L母液，母液。依次称取
KI
0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g
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细胞生物学实验课
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
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细胞生物学实验课
细胞的消化传代方法
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细胞生物学实验课
生长细胞形态
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细胞生物学实验课
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
细胞生物学实验技术.ppt
色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。
3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再 将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 5. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。
二、免疫细胞化学 immunocytochemistry
LCSM
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； • 能显示细胞样品的立体结构； • 分辨力是普通光学显微镜的3倍；
• 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成
立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
LCSM Image of a Xenopus Melanophore
级电子信号。
SEM LIGHT PATHWAY
人类红细胞
酵母
三、显微操作技术 micromanipulation technique
• 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操
作的一种方法。
• 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及 显微切割等。
– 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等 将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。
机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度
的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘 液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。
三、细胞电泳
• 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电 荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 • 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量 有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。
核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热
医学细胞生物学实验_PPT幻灯片
颗粒白细胞 嗜中性颗粒白细胞；嗜酸性颗粒白细胞；嗜碱性颗粒白 细胞
无颗粒白细胞 淋巴细胞；单核细胞
血小板
【作业】 绘图：各种细胞的形态结构，并标示出 细胞的各部分
实验报告要求：
实验名称： 实验目的： 实验原理： 实验步骤： 实验结果和分析：
实验二 线粒体的超活染色 和细胞显微结构的观察
【实验步骤】
A. DNA和RNA的定位
制备蛙血涂片1张，晾干。 固定：70％乙醇固定5min。 染色：滴1d甲基绿-哌洛宁染液染色5-10min，
水冲洗后在纯丙酮中分化处理2-3s。 观察绘图
【实验步骤】
B. 血细胞计数
制备蛙血细胞悬液，稀释400-600× 熟悉血细胞计数板，找到计数室和计数区域 盖玻片盖在计数板槽上，吸取1d血细胞悬液滴在盖
【作业】
绘图：人口腔上皮细胞（显示线粒体） 小鼠肝细胞（显示线粒体） 兔脊神经节细胞（显示高尔基体）
光镜下高尔基复合体
实验三 细胞内核酸的定位 和细胞计数
【实验目的】
掌握细胞化学技术定位细胞组分的一般方法； 掌握细胞内核酸的分布特点； 掌握活细胞计数的方法。
【实验原理】
A. 细胞化学染色与DNA和RNA的定位
核酸分为DNA和RNA，呈酸性, 可与碱性染料 反应而显色和定位。由于两类核酸分子聚合程 度不同，对不同的碱性染料亲和力不同，甲基 绿-哌洛宁染料的两种组分分别对DNA和RNA 有高亲和力，并分别将二者染成蓝绿色和红色。
【实验原理】
B. 细胞计数
血细胞计数板包括2个计数室，每个计数室有9个 大格，每大格的体积为0.1mm3，计数4大格内（4 个角）的细胞数，根据每大格的体积和细胞悬液 的稀释倍数即可算出细胞密度。
玻片外侧边缘，使其渗入计数室 10×物镜下计数（四角的4大格） 细胞密度换算： 细胞数/ml=4大格细胞数/4 ×10000×稀释倍数
无颗粒白细胞 淋巴细胞；单核细胞
血小板
【作业】 绘图：各种细胞的形态结构，并标示出 细胞的各部分
实验报告要求：
实验名称： 实验目的： 实验原理： 实验步骤： 实验结果和分析：
实验二 线粒体的超活染色 和细胞显微结构的观察
【实验步骤】
A. DNA和RNA的定位
制备蛙血涂片1张，晾干。 固定：70％乙醇固定5min。 染色：滴1d甲基绿-哌洛宁染液染色5-10min，
水冲洗后在纯丙酮中分化处理2-3s。 观察绘图
【实验步骤】
B. 血细胞计数
制备蛙血细胞悬液，稀释400-600× 熟悉血细胞计数板，找到计数室和计数区域 盖玻片盖在计数板槽上，吸取1d血细胞悬液滴在盖
【作业】
绘图：人口腔上皮细胞（显示线粒体） 小鼠肝细胞（显示线粒体） 兔脊神经节细胞（显示高尔基体）
光镜下高尔基复合体
实验三 细胞内核酸的定位 和细胞计数
【实验目的】
掌握细胞化学技术定位细胞组分的一般方法； 掌握细胞内核酸的分布特点； 掌握活细胞计数的方法。
【实验原理】
A. 细胞化学染色与DNA和RNA的定位
核酸分为DNA和RNA，呈酸性, 可与碱性染料 反应而显色和定位。由于两类核酸分子聚合程 度不同，对不同的碱性染料亲和力不同，甲基 绿-哌洛宁染料的两种组分分别对DNA和RNA 有高亲和力，并分别将二者染成蓝绿色和红色。
【实验原理】
B. 细胞计数
血细胞计数板包括2个计数室，每个计数室有9个 大格，每大格的体积为0.1mm3，计数4大格内（4 个角）的细胞数，根据每大格的体积和细胞悬液 的稀释倍数即可算出细胞密度。
玻片外侧边缘，使其渗入计数室 10×物镜下计数（四角的4大格） 细胞密度换算： 细胞数/ml=4大格细胞数/4 ×10000×稀释倍数
细胞生物学实验课件ppt-PowerPointPres
实验内容与实施过程
4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学 生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成 功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提 醒预习下节课实验内容，提问。共150分钟。
实验作业
1.细胞间凝集的原理是什么？ 2.简图表示血细胞凝集原理.
实验总结
1.为什么对照组有PBS液作对照呢？ 没什么巧，因为凝集素中本身含PBS缓冲
液，当含本身凝集素是不含PBS的，只是因为 本实验中凝集素的提取时用到了PBS.
实验总结
2.那么红细胞悬液是怎么制备的呢？ 其实也不难，无菌抽取动物静脉血液，当然血液
抽出来后肯定要先加抗凝剂了，然后再加生理盐水。 那么怎么从血液中将红细胞分离出来呢？想想，血液 中有血清、红细胞、白细胞和血小板，按道理来讲红 细胞应该最重吧(有待查证)，用离心机在2000r/min下 离心5min，去掉上清液，得到的应该就是红细胞了， 再加适量生理盐水洗涤几次后，加一定量是(按压积 红细胞体积算)生理盐水即可配成相应浓度的红细胞 悬液了。
三、实验仪器
普通离心机、 组织捣碎机、 粗天平、荧 光显微镜。
烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴 管20支, 10ml刻度离心管20 支, 试管架5个，纱布若干， 无荧光载片和盖片各4片。
四、实验材料
新鲜 菠菜
五、实验内容与实施过程
（一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，
2. 掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝聚
的原理。
3. 观察凝集的现象
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二、 实验原理
①细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细 胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、 免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。
细胞生物学实验ppt课件
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镜普 通 复 氏 显 微
镜相 差 显 微
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镜暗 视 野 显 微
镜荧 光 显 微
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3、如何提高显微镜 分辨率
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8
1、数片孔径：孔径愈大，显微镜能力俞强。 2、分辨率：分辨率以分辨俩点之间的最小距离表示。 目镜与显微镜的分辨率无关，物镜的分辨率即为显微 镜的分辨率，照明光线波长越短，物镜的数值孔径越
大显微镜的分辨率的越大。 3、放大率：总放大率超过物镜数值孔径的1000倍时， 细微结构分辨不清，为空的放大， 低于500倍时由于放大率过低，肉眼难以分辨。 4、焦点深度：焦深加大，总放大率提高。
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三、实验器材
观察材料（草履虫，洋葱内表皮，紫鸭趾 草等花粉，菠菜叶），普通光学显微镜， 暗视野显微镜，相差显微镜，荧光显微镜， 载玻片，盖玻片，吸管，镊子，剪刀等。
观察。
3．紫鸭趾草花粉外形、表面突起的观察在载玻片
上滴一滴水，取紫鸭趾草雄蕊在其中沾几下，然后
盖片观察。
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实验一、几种光学显微镜的使用
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1
一、实验目的：
了解几种光学显微镜的结构、使用 方法、工作原理等。 掌握使用普通光学显微镜提高分辨 率的方法。
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二、实验原理ห้องสมุดไป่ตู้
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3
1、基本原理
一般光学显微镜主要是由目镜、物镜、 聚光器以及反光镜等构成。 各种光学显微镜的放大原理基本相同， 各种特殊用途的显微镜只是在主要器 件上进行了稍微改动而已。
医学细胞生物学实验细胞的某些生理活动.ppt
2021/3/27
动物细胞的吞噬活动
实验步骤
淀粉肉汤
鸡红细胞
生理盐水
滴腹腔液于 载玻片上
收腹腔液
处死小鼠
盖盖玻片
镜检观察
2021/3/27
动物细胞的吞噬活动
实验结果
巨噬细胞 鸡红细胞 巨噬细胞核
开始阶段
进行阶段
完成阶段
小鼠巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
2021/3/27
实验报告
填表 绘图
2021/3/27
实验报告：填表
不同氯化钠溶液中鸡红细胞形态的变化
2021/3/27
实验报告：绘图-具体的三个阶段
巨噬细胞 鸡红细胞 巨噬细胞核
开始阶段
进行阶段
完成阶段
小鼠巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用
2021/3/27
实验内容
❖ 细胞膜的渗透性； -动物细胞的渗透性(鸡红细胞) -植物细胞的渗透性(洋葱细胞)
❖ 细胞的吞噬作用
2021/3/27
细胞膜的渗透性实验
实验原理
细胞膜具有选择透过性，水分子能以简单扩散 的方式自由通过细胞膜，而带电离子则不能自由通 透。如果细胞内外存在着渗透压的差别，水分子较 多地由渗透压低(离子浓度较低)的一侧，向渗透压 高(离子浓度较高)的一侧扩散。因此，在高渗透压 环境中，动物细胞因失水而皱缩，在低渗透压环境 中，细胞因吸水而膨胀、甚至破裂。
实验结果
低渗透下的鸡红细胞 正常形态鸡红细胞 高渗透下的鸡红细胞
鸡红细胞在不同氯化钠溶液中的形态
动物细胞的吞噬活动
实验步骤
淀粉肉汤
鸡红细胞
生理盐水
滴腹腔液于 载玻片上
收腹腔液
处死小鼠
盖盖玻片
镜检观察
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动物细胞的吞噬活动
实验结果
巨噬细胞 鸡红细胞 巨噬细胞核
开始阶段
进行阶段
完成阶段
小鼠巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用
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实验报告
填表 绘图
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实验报告：填表
不同氯化钠溶液中鸡红细胞形态的变化
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实验报告：绘图-具体的三个阶段
巨噬细胞 鸡红细胞 巨噬细胞核
开始阶段
进行阶段
完成阶段
小鼠巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用
2021/3/27
实验内容
❖ 细胞膜的渗透性； -动物细胞的渗透性(鸡红细胞) -植物细胞的渗透性(洋葱细胞)
❖ 细胞的吞噬作用
2021/3/27
细胞膜的渗透性实验
实验原理
细胞膜具有选择透过性，水分子能以简单扩散 的方式自由通过细胞膜，而带电离子则不能自由通 透。如果细胞内外存在着渗透压的差别，水分子较 多地由渗透压低(离子浓度较低)的一侧，向渗透压 高(离子浓度较高)的一侧扩散。因此，在高渗透压 环境中，动物细胞因失水而皱缩，在低渗透压环境 中，细胞因吸水而膨胀、甚至破裂。
实验结果
低渗透下的鸡红细胞 正常形态鸡红细胞 高渗透下的鸡红细胞
鸡红细胞在不同氯化钠溶液中的形态
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显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立 即终止消化
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
细胞的消化传代方法
生长细胞形态
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
4、金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠化传代方法
吸除或倒掉旧培养液
加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）
肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟
分别在5min、15min、20min观察细胞融合
细胞融合
2、PCC诱导和观察
90分钟后离心弃上清 加入0.075mol/lKCl8ml
混匀37℃25分钟 加入1ml固定液混匀离心弃上清
加7ml固定液固定20min 离心弃上清加0.5ml固定液 滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min
水冲、晾干、镜检
细胞工程实验
新乡医学院生命科学实验教学中心
课程组成员：杨慈清 、李虎、王红霞、许重洁
办公电话：3029114
目录
实验一 动物细胞的培养 实验二 细胞融合技术与染色体提前凝集标本制 备实验三 小鼠MEF饲养层的制备 实验四 MS培养基的配制和愈伤组织诱导 实验五 原生质体的分离、纯化和活力鉴定
实验一 动物细胞的培养
显微镜下的培养细胞
三、实验方法
方法
1、玻璃器材的清洗处理方法 2、塑料器材的清洗处理方法 3、橡皮器材的清洗处理方法 4、金属器材的清洗处理方法 5、细胞的消化传代方法
1、玻璃器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗
清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜
自来水冲10次
单蒸水洗2次
晾干备用
培养瓶再用三蒸水浸泡过夜
晾干
包装
灭菌 备用
2、塑料器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜
（单用或交叉处理） 水洗10次 单蒸水2次
三蒸水浸泡过夜 晾干
紫外线或辐射灭菌备用
3、橡皮器材的清洗处理方法
浸泡 刷洗
5%NaOH煮10 ′ ～20′ 水洗
4%盐酸煮10 ′ ～20′ 水洗8~10次
单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用
将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－ 6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较 高，而且生长状态也很好。在制备饲养层 前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处 理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能 的基础上失去增值能力，以免与ES的生长 发生竞争。
在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作 为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度 都会影响饲养层培养体系的质量。
三、实验方法
1、细胞融合方法 2、PCC诱导和观察
1、细胞融合方法
收集1瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离 心用Hank’s液洗1次
离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散
37℃滴加50％PEG0.5ml（12滴）
90s后
加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心 加入2ml 1640（含10％血清） 加一滴秋水仙素（10μg／ml ）
一、实验目的
1. 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过 除菌法的操作。
2. 了解化学消毒法的使用方法。 3. 了解传代细胞的传代方法及操作过程，
学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况及细胞增殖动力学测定的方法。
二、实验原理
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严 谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长， 必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所 必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、 维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、 适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调 节。二是严格控制无菌条件。
胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下， 且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态 小，躯干部分不易分辩，操作困难。
细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容 易纯化。
丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。
二、实验方法与步骤
1.MEF的获取：
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF）
实验二 细胞融合技术与染色体 提前凝集标本制备
一、实验目的
通过细胞融合技术，初步了解染色体 提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞 三种时相的提前凝集染色体特点。
二、实验原理
M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无 种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基 础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。 即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I 期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染 色 体 称 提 前 凝 集 的 染 色 体 (Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。
四、作业与思考
1. 根据PCC图像的观察，试说明对于理 解细胞周期和DNA复制有什么启示?
2. 简述细胞融合的原理。 3. PCC实验的主要意义是什么？
实验三 小鼠MEF饲养层的制备
一、实验目的
1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。 2.巩固细胞培养相关的的技术。
二、实验原理
胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）的体外培养要 求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外 培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因 子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞 生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值， 后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作 饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞 （mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于铺层， 分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
细胞的消化传代方法
生长细胞形态
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
4、金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠化传代方法
吸除或倒掉旧培养液
加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）
肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟
分别在5min、15min、20min观察细胞融合
细胞融合
2、PCC诱导和观察
90分钟后离心弃上清 加入0.075mol/lKCl8ml
混匀37℃25分钟 加入1ml固定液混匀离心弃上清
加7ml固定液固定20min 离心弃上清加0.5ml固定液 滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min
水冲、晾干、镜检
细胞工程实验
新乡医学院生命科学实验教学中心
课程组成员：杨慈清 、李虎、王红霞、许重洁
办公电话：3029114
目录
实验一 动物细胞的培养 实验二 细胞融合技术与染色体提前凝集标本制 备实验三 小鼠MEF饲养层的制备 实验四 MS培养基的配制和愈伤组织诱导 实验五 原生质体的分离、纯化和活力鉴定
实验一 动物细胞的培养
显微镜下的培养细胞
三、实验方法
方法
1、玻璃器材的清洗处理方法 2、塑料器材的清洗处理方法 3、橡皮器材的清洗处理方法 4、金属器材的清洗处理方法 5、细胞的消化传代方法
1、玻璃器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗
清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜
自来水冲10次
单蒸水洗2次
晾干备用
培养瓶再用三蒸水浸泡过夜
晾干
包装
灭菌 备用
2、塑料器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜
（单用或交叉处理） 水洗10次 单蒸水2次
三蒸水浸泡过夜 晾干
紫外线或辐射灭菌备用
3、橡皮器材的清洗处理方法
浸泡 刷洗
5%NaOH煮10 ′ ～20′ 水洗
4%盐酸煮10 ′ ～20′ 水洗8~10次
单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用
将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－ 6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较 高，而且生长状态也很好。在制备饲养层 前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处 理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能 的基础上失去增值能力，以免与ES的生长 发生竞争。
在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作 为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度 都会影响饲养层培养体系的质量。
三、实验方法
1、细胞融合方法 2、PCC诱导和观察
1、细胞融合方法
收集1瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离 心用Hank’s液洗1次
离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散
37℃滴加50％PEG0.5ml（12滴）
90s后
加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心 加入2ml 1640（含10％血清） 加一滴秋水仙素（10μg／ml ）
一、实验目的
1. 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过 除菌法的操作。
2. 了解化学消毒法的使用方法。 3. 了解传代细胞的传代方法及操作过程，
学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况及细胞增殖动力学测定的方法。
二、实验原理
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严 谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长， 必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所 必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、 维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、 适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调 节。二是严格控制无菌条件。
胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下， 且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态 小，躯干部分不易分辩，操作困难。
细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容 易纯化。
丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。
二、实验方法与步骤
1.MEF的获取：
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF）
实验二 细胞融合技术与染色体 提前凝集标本制备
一、实验目的
通过细胞融合技术，初步了解染色体 提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞 三种时相的提前凝集染色体特点。
二、实验原理
M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无 种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基 础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。 即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I 期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染 色 体 称 提 前 凝 集 的 染 色 体 (Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。
四、作业与思考
1. 根据PCC图像的观察，试说明对于理 解细胞周期和DNA复制有什么启示?
2. 简述细胞融合的原理。 3. PCC实验的主要意义是什么？
实验三 小鼠MEF饲养层的制备
一、实验目的
1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。 2.巩固细胞培养相关的的技术。
二、实验原理
胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）的体外培养要 求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外 培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因 子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞 生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值， 后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作 饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞 （mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于铺层， 分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。