纳豆激酶_聂光军

文章编号： １０００－１３３６（２００９）01－0134-04

纳豆激酶

聂光军 岳文瑾

（安徽工程科技学院生物化学工程系，芜湖２４１０００）

摘要：纳豆激酶是一种枯草杆菌酶，具有较强的纤溶活性和溶栓功能，是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物。目前，纳豆激酶分离方法、纳豆激酶功能、结构及其应用、纳豆激酶工程菌构建已成为纳豆激酶的研究热点，也成为未来纳豆激酶研究的导向。关键词：纳豆激酶；基因工程菌中图分类号：Ｑ５５

收稿日期：　２００８－０９－２４

安徽省高校自然科学基金项目（ＫＪ２００７Ｂ１１４）；芜湖市科技计划重点项目（２００７－１２６）资助

作者简介：聂光军（１９７６－），男，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｏｉｎ－ｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；岳文瑾（１９７９－），女，硕士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｎｊｉｎ＿７９＠１６３．ｃｏｍ

目前，全球每年因血栓病致死人数达１２００万人，接近世界总死亡人数的四分之一。抗血栓药物需求量很大，但临床使用的抗血栓药物普遍存在着稳定性差和药效短等缺点，迫切需要一种低价高效、易吸收、体内半寿期长以及使用方便的治疗心脑血管疾病的药物或保健品。纳豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，　ＮＫ）是一种高效血栓溶解酶，具有较好的纤溶活性和溶栓功能，它源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全性高［１］。因此，世界上很多国家都在研究ＮＫ，其中日本的研究较为广泛深入。我国很多高校和研究院所也在进行ＮＫ的研究。近期研究主要包括ＮＫ的酶学性质、结构、功能及其应用研究，以及ＮＫ的提取工艺、工程菌构建等。１． ＮＫ的稳定性

影响ＮＫ稳定性的主要因素有温度、ｐＨ值和金属离子等。ＮＫ低于４５　ºC 时活性相对稳定，高于６０ºC 逐渐失活，反复冻融５次后，该酶仍能保持９５％以上的活性。室温下，在ｐＨ　７￣１２范围内较为稳定，ｐＨ　７￣９范围内酶活性最为稳定，但ｐＨ＜５性质则不稳定。王萍等报道［２］ＮＫ纤溶活性最适ｐＨ为８．０，ｐＨ　６￣１０溶液中４０　ºC 以下基本稳定，ｐＨ＜５失去纤溶活性。模

拟胃环境的酸性条件下，粗酶失去纤溶活性，而纳豆浸提液纤溶活性保持２５％。与煮沸的米汤、肉汤或血清蛋白、胃黏液混合可以明显提高该酶的稳定性，甚至在ｐＨ　２￣３的酸性条件还可保持７．５％的活性［３］，因此，ＮＫ在黏性环境下可提高耐酸性，进而推测其在胃肠中具有较好的稳定性，进一步验证其具有口服药物的开发价值。此外，添加甘油、丙二醇、牛血清蛋白、明胶、海藻酸钠等也有利于提高酶的热稳定性。

ＮＫ的活性还受一些金属离子的影响。Ｈｇ２＋会使其完全失活，Ｃｕ２＋、Ｚｕ２＋、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋等离子对该酶有不同的抑制作用，而Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋则对其有激活作用。此外，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＦＰ（二异丙基氟磷酸）和５　ｍｍｏｌ／Ｌｎｅｇｕｖｏｎ则能完全抑制ＮＫ的活性［４］。２． ＮＫ活性中心的保守性和底物的特异性

ＮＫ具有保守性的催化中心（Ｄ３２、Ｈ６４、Ｓ２２１和Ｎ１５５），如图１、２所示，在与不同底物反应时，其催化中心的位置及氨基酸组成都没有发生变化。研究发现ＮＫ对血浆纤溶酶底物Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐＮＡ最敏感，对凝血酶底物Ｓ－２２３８（Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｉｐ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）和激肽释放酶底物Ｓ－２３０２（Ｈ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）也有一定活性，而对尿激酶底物Ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ和弹性蛋白酶底物Ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐＮＡ不起作用。另据报道［５］，ＮＫ对枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶的底物Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ也有高度水解活性。以氧化型胰岛素Ｂ链为作用底物，研究ＮＫ的酶切特性，发

现ＮＫ有严格的识别位点及限制性酶切位点：首选酶切位点在Ｌｅｕ１５－Ｔｙｒ１６；其次在Ｓｅｒ９－Ｈｉｓ１０；在Ｇｌｎ４－Ｈｉｓ５及Ｈｉｓ５－Ｌｅｕ６也有微弱的水解活性。因此，ＮＫ催化中心是保守的，其底物具有特异性。３． ＮＫ的分离提取

ＮＫ是胞外酶，与细胞、细胞碎片、其他代谢产物、残存底物及惰性组分等混合在一起，分离难度大，成本高。目前，对于ＮＫ的分离纯化研究很多，艺已较成熟。

３．１　传统的分离方法 ＮＫ传统的分离方法是从固体发酵纳豆中分离纯化ＮＫ，并经过４次盐析，３次层

析操作。因此该分离工艺步骤多，时间长，导致产品得率偏低（１８％￣５０％），分离成本提高以及活性降低等问题。

为了解决上述问题，采用发酵与泡载偶合的分离方法，初步纯化ＮＫ，再经超滤脱盐，层析，分离得到了比活为９８００　ＩＵ／（ｍｇ蛋白质）的ＮＫ，回收率为８５．５％。刘俊果等［７，８］采用反胶团萃取技术分离ＮＫ，该方法步骤少、选择性高、成本低，经过一次萃取循环，蛋白质回收率为３３．２５％，酶活性回收率为８０％。３．２　双水相亲和分配技术 目前，改进生物分离方法最主要的工作是缩短流程和提高单元分离的效率。分离技术的高效集成化使生物分离过程出现一个质的转变，即利用已有的或新近开发的生物分离技术，

将下游过程中的有关单元进行有效集成，或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品得率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。

亲和层析法的优点是选择性高、步骤少，但发酵液须经过一系列的前处理才能进行分离，而双水相分配技术则可以直接处理液固混合物，因此，二者结合可形成处理量大、效率高、选择性强的双水相亲和分配组合技术。陆瑾等［９］对ＰＥＧ４０００的羟基进行活化，以亚氨基二乙酸（ＩＤＡ）为螯合剂，制取含有Ｃｕ２＋的金属螯合亲和配基ＰＥＧ－ＩＤＡ－Ｃｕ（ＩＩ），并以ＰＥＧ和羟丙基淀粉（ＰＥＳ）形成双水相，用于直接处理ＮＫ的发酵液，如图３所示，经过两次分配分离流程后，ＮＫ的总回收率为８１％，纯化因子达到３．５２。３．３　膨胀床吸附技术 膨胀床吸附技术（ＥＢＡ）是一项在

产物捕获阶段实现的过程集成生物分离技术，集固液分离、浓缩和初期纯化于一体，能直接从含有固体颗粒的发酵液捕获目标产物，减少操作步骤，降低分离过程的复杂程度，提高分离效率和产品的得率。胡洪波等［１０］采用了离子交换型膨胀床吸附剂对发酵液中的ＮＫ进行了分离纯化，并与传统分离工艺进行了比较。结果表明，传统分离方法设备需求多、药品消耗大。与传统方法相比，膨胀床法分离纯化ＮＫ，操作步骤从６步减少为２步，操作时间缩短了８￣１０小时，回收率提高了约５０％。

３．４　基因重组定向分离技术 基因重组技术促进了代谢产物定向分离技术的发展，为生物分离技术的发展开辟新的研究领域。Ｌｉ等［１１］应用ＤＮＡ重组技术，

图１　ＮＫ与Ｈ－Ｄ－ＶＬＫ－ｐＮＡ结合的三维模式图［６］

图２　ＮＫ与底物Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ结合的三维模式图

［６］