第六章分子生物学基本研究法(下)
分子生物学课程教学大纲
分子生物学课程教学大纲课程名称：分子生物学（Molecular Biology）课程编号：1313072215课程类别：专业课总学时数：68 课内实验时数：18学分：3.5开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子生物学为高等学校生物技术专业学生必修的一门专业基础课，是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
通过分子生物学的教学，应使学生了解分子生物学的发展历史以及最新研究成果；熟练掌握DNA的结构与功能、RNA在蛋白质合成中的功能、蛋白质的结构与功能、遗传密码及基因表达调控的本质；了解现代分子生物学基本研究方法，并能运用分子生物学的理论知识分析、研究和解决问题，为进一步学习有关专业课程及从事基因工程领域的研究工作奠定基础。
二、本课程与其它课程的联系与分工从学科角度来讲，分子生物学涵盖面非常广，与生物学、生物化学和细胞生物学、遗传学等生命科学课程有交叉，《生物化学》是先修课程。
三、教学内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”；△表示自学内容；○表示略讲内容；第一章绪论第一节引言创世说与进化论[1]；细胞学说[2]；经典的生物化学和遗传学[3]；DNA的发现[2]第二节分子生物学简史[1]第三节分子生物学研究的主要内容分子生物学的含义[3]；DNA重组技术、基因工程技术概念[3]；分子生物学研究的主要内容[3]第四节展望分子生物学的一些分支学科[1]；分子生物学发展的趋势[1]重点：分子生物学的含义和研究内容难点：分子生物学的研究内容教学手段：多媒体教学教学方法：讲授法作业：1．简述阵德尔、摩尔根和沃森等人对分子生物学发展的主要贡献。
分子生物学-课件-分子生物第六章可编辑全文
• 使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度 (Tm)、变性温 度、熔点
• DNA的解链温度一般在82-95℃ ，与DNA的分子大小和碱基组成、 溶液的pH值和离子强度（+）等有关
二、复性
• DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新 形成互补双链结构
且RNA的完整性和纯度都很高
3、氯化锂-尿素法
• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA 酶，氯化锂选择性沉淀RNA
• 缺点：存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会 丢失一些小分子RNA，如5sRNA等
• 优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大 量样品少量组织细胞的RNA提取
4·热酚法
• 将异硫氰酸胍、巯基乙醇和SDS等联合使用，可以快速裂 解细胞，解离核蛋白复合物，释放RNA，并有效抑制 RNase的活性
• 在某些理化因素的作用下，维 系核酸二级结构的氢键和碱基 堆积力受到破坏，DNA双螺旋 结构松散，变成单链的过程称 为核酸的变性
• 核酸双螺旋区的氢键断裂，变 成单链，但并不涉及共价键的 断裂
DNA解链曲线
DNA变性的本质是氢键的断裂
核酸的变性因素
• 变性方法
–热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、 尿素和甲酰胺 ）
(3)煮沸裂解法
• 以溶菌酶、Triton裂解细菌，然后以沸水浴加热，不 仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNA、质 粒DNA变性
• 当降低温度时，闭环质粒DNA复性留在上清液中，而 染色体DNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过 离心除去
• 在离心上清液中加入有机溶剂 (例如异丙醇)便得到质 粒DNA粗品沉淀
分子生物学基础
分子生物学基础分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科，是现代生物学的重要组成部分。
通过对生物分子的研究，可以深入了解细胞的机制、生命的起源和演化，以及疾病的发生和治疗等方面。
本文将介绍分子生物学的基本概念、研究方法和应用领域等。
一、基本概念1. 生物分子：生物体内存在着许多不同种类的分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质等。
这些分子构成了细胞的基本单位，参与了各种生物过程。
2. DNA：脱氧核糖核酸（DNA）是生物体中重要的遗传物质，携带了生物个体遗传信息的蓝图。
DNA由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞嘌呤）组成，以双螺旋结构存在。
3. RNA：核糖核酸（RNA）是DNA的姐妹分子，具有多种功能。
其中信使RNA（mRNA）通过转录过程将DNA编码的信息转化为蛋白质合成的模板。
4. 蛋白质：蛋白质是生物体内最重要的功能性分子。
它们由氨基酸组成，通过肽键连接成链状结构。
蛋白质不仅构成了细胞的结构，还具有调节代谢、传递信号和催化反应等生物功能。
二、研究方法1. 分子克隆：分子克隆是指将DNA或RNA片段插入载体（如质粒）中，通过细菌或其他生物体来复制这些分子片段。
这一技术可以用于生物工程、基因治疗等领域。
2. PCR：聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增DNA片段的方法。
它利用特定引物和DNA聚合酶，通过一系列温度循环反复合成DNA的同源链，扩增目标序列。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种常用的分离生物分子的方法。
通过在凝胶中施加电场，根据分子的大小和电荷来分离DNA、RNA和蛋白质等。
4. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种常用的体外扩增DNA片段的方法。
通过引物的特异性与DNA片段的互补性，聚合酶可以复制和扩增模板DNA。
三、应用领域1. 基因工程：分子生物学的发展为基因工程提供了基础。
通过基因重组、转基因等技术，可以克隆和改造DNA，生产重组蛋白质、植物转基因等。
2. 遗传疾病诊断：分子生物学的方法在遗传疾病的诊断中起着关键作用。
分子生物学考点整理1
分子生物学考点整理符广勇朱兰第一章．绪论一、分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子结构与功能相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘、由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
二、重组DNA技术又称基因技术，是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
三、基因表达的调控基因表达的调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。
四、转录因子转录因子是能与基因5`端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
第二章．染色体与DNA一、染色体上的蛋白质染色体上的蛋白质主要包括组蛋白和非组蛋白。
根据凝胶电泳性质可以把组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3、H4。
这些组蛋白都含有大量的赖氨酸和精氨酸。
二、组蛋白的特性1．进化上的极端保守性不同种生物组蛋白的氨基酸组成是十分相似的，特别是H3、H4。
2.无组织特异性到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白这两个例外。
3．肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。
4.组蛋白的修饰作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化。
5.富含赖氨酸的组蛋白H5三、HMG蛋白叫高迁移率蛋白四、真核细胞DNA序列的分类1.不重复序列2.中度重复序列3.高度重复序列重复序列的意义：若某一重复序列出现错误，对基因的影响不大，稳定性较高；在短时间内可同时产生大量的基因产物。
重复序列的应用:应用于分子标记的作用：卫星DNA（便于分子标记）和微卫星DNA五、真核生物基因组与原核生物基因组的区别1.真核基因组庞大，原核生物基因组小2.真核基因组存在大量的重复序列，原核基因组没有重复序列3.真核基因组大部分是非编码序列，原核基因组大多是编码序列4.真核基因组的转录产物为单顺反子，原核基因组转录产物多为多顺反子5.真核基因是断裂基因，有内含子结构，原核基因为连续基因，几乎没有内含子结构6.真核基因组存在大量的顺式作用原元件，包括启动子、增强子和沉默子等，原核基因组基本没有增强子和沉默子7.真核基因组存在大量的DNA多态性，原核基因组很少有8.真核基因组具有端粒结构，原核基因组没有端粒结构六、重叠基因（Overlapping gene）指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上的基因的组成部分。
分子生物学研究方法教案
分子生物学研究方法教案一、教学目标1、让学生了解分子生物学的基本概念和研究范畴。
2、使学生掌握常见的分子生物学研究方法，包括其原理、操作步骤和应用领域。
3、培养学生的实验设计能力和科学思维，能够运用所学方法解决实际问题。
二、教学重难点1、重点（1）PCR 技术的原理和应用。
（2）核酸电泳技术的原理和操作。
（3）基因克隆的基本流程。
2、难点（1）PCR 反应体系的优化和常见问题的解决。
（2）基因克隆中载体的选择和构建。
三、教学方法1、讲授法：讲解分子生物学研究方法的基本原理和关键步骤。
2、演示法：通过多媒体展示实验过程和结果，增强学生的直观感受。
3、讨论法：组织学生讨论实验设计和结果分析，培养学生的思维能力。
四、教学过程1、课程导入（1）通过介绍一些与分子生物学相关的疾病诊断、基因治疗等实际应用案例，引起学生的兴趣，引出分子生物学研究方法的重要性。
2、分子生物学研究方法概述（1）简单介绍分子生物学的定义和研究对象，如 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。
（2）列举常见的分子生物学研究方法，如 PCR、核酸电泳、基因克隆、DNA 测序等。
3、 PCR 技术（1）原理：讲解 PCR 技术的基本原理，即通过高温变性、低温退火和适温延伸的循环过程，实现 DNA 片段的指数扩增。
（2）反应体系：介绍 PCR 反应体系的组成成分，包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等，并说明各成分的作用。
（3）操作步骤：详细讲解 PCR 的操作步骤，包括模板 DNA 的制备、引物设计、反应体系的配制、PCR 扩增程序的设置等。
（4）应用：举例说明 PCR 技术在基因诊断、遗传分析、物种鉴定等方面的应用。
4、核酸电泳技术（1）原理：解释核酸电泳的原理，即根据核酸分子在电场中的迁移速率不同来分离和鉴定核酸片段。
（2）琼脂糖凝胶电泳：介绍琼脂糖凝胶电泳的操作方法，包括凝胶的制备、样品的加载、电泳条件的设置等。
《现代分子生物学》教学大纲
《现代分子生物学》教学大纲课程名称：现代分子生物学课程类别：专业必修课学时：48 学时学分：3学分考核方式：考试适用专业：生物技术开课学期：第5或6学期一、课程性质、目的任务分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。
自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。
生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。
现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了分子生物学的蓬勃发展。
本课程是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的学科，也是生物专业的主干课程，分子生物学已成为生物类各专业教学计划中重要的核心课程，因此它是十分重要的一门必修课程，也是培养造就生物技术和生命科学高层次专门人才所需基本素质的重要课程。
本门课程的主要内容包括：染色体与DNA、基因和基因组、现代分子生物学的研究方法与技术、转录、翻译、原核生物基因表达与调控、真核生物基因表达调控、发育与分子调控等，此外，还包括各种讲座。
总之，通过分子生物学知识的传授，培养学生从分子水平上去分析、理解生命现象与过程，提高学生思考与探索生命奥秘的能力，从而为生物技术的分子生物学实验提供详实的理论基础。
二、课程基本要求该课程要求学生掌握现代分子生物学基本理论和基本技术，为其它专业课的学习和今后的发展奠定基础。
在课程学习的同时，要求学生提高思想道德修养、自学能力、专业英语能力、应用知识能力、表达能力、创新能力和科研能力。
三、学时分配四、教学方法与考核(一) 教学方法1．以学科体系为主体，以应用为目的，教学过程加强针对性和实用性。
2．本课程以讲授为主、自学和讨论为辅的方式组织教学，并通过阅读主要参考书目、网上查询、资料整理和专题讨论，加深对细胞生物学了解，并掌握该学科的实验技能和操作。
现代分子生物学第六章习题参考答案
现代分子生物学第六章习题参考答案1、列举两种研究基因表达模式的方法并简述原理。
答：⑴基因表达系列分析技术：它是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。
⑵基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
3、简述基因芯片技术对分子生物学研究的意义。
答：基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。
而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。
4、比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点。
答：⑴酵母双杂交技术优势：1、大规模筛选；2、操作简单，直观（可以用荧光做报告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等）缺点：1、传统的酵母双杂交技术不能研究膜蛋白的相互作用，由此派生出的新技术研究膜蛋白的相互作用较困难；2、酵母双杂交技术研究的目的蛋白相互作用需在酵母细胞核内发生相互作用，那么新的问题产生了：如果酵母双杂交技术显示两个蛋白相互作用（也就是在酵母细胞核内，这两个蛋白确实相互作用），但是两个相互作用蛋白在原宿主内却位于不同细胞器（也就是他们不可能出现在同一个位置），那么假阳性就产生了，由此出现的例子很多。
⑵免疫共沉淀技术(Co-IP)优势：该技术能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬时事件，如实、完整地反映DNA与蛋白质的动态结合；缺点：难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息，或目标蛋白不是直接地与染色质结合等。
分子生物学总结
分⼦⽣物学总结分⼦⽣物学总结第⼀章绪论⼀. DNA重组技术和基因⼯程技术.DNA重组技术⼜称基因⼯程,⽬的是将不同的DNA⽚段按照⼈们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达.产⽣影响受体细胞的新的遗传性状.基因⼯程技术还包括其他可能使⽣物细胞基因组结构得到改造的体系.第⼆章染⾊体与DNA⼀. DNA的⼀、⼆、三级结构特征.DNA⼀级结构特征1. 双链反向平⾏配对⽽成2. 脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA⾻架，碱基排在内侧3. 内侧碱基通过氢键互补形成碱基对DNA⼆级结构特征绕DNA双螺旋表⾯上出现的螺旋沟，宽的沟称为⼤沟，窄沟称为⼩沟。
⼤沟，⼩沟都、是由于碱基对堆积和糖-磷酸⾻架扭转造成的。
DNA三级结构特征拓扑异构酶拓扑异构酶负超螺旋松弛DNA 正超螺旋溴已啶溴已啶⼆. 原核⽣物DNA具有哪些不同于真核⽣物DNA的特征.1. 结构简练2. 存在转录单元3. 有重叠基因三. DNA复制通常采取哪些⽅式.1. 线性DNA双链的复制.2. 环状DNA双链的复制分为θ型、滚环型和D-环型等.四. 原核⽣物DNA的复制特点.1. DNA双螺旋的解旋2. DNA复制的引发3. 冈崎⽚段与半不连续复制4. 复制的终⽌5. DNA聚合酶五. 细胞通过哪⼏种修复系统对DNA损伤进⾏修复?1. 错配修复2. 碱基切除修复3. 核苷酸切除修复4. DNA直接修复六. 什么是转座⼦?可分为哪些种类?转座⼦是存在与染⾊体DNA上可⾃主复制和位移的基本单位原核⽣物转座⼦的类型: 1. 插⼊序列 2. 复合转座⼦ 3. TnA家族第三章⽣物信息的传递(上)⼀. 什么是编码链?什么是模板链?与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链；将另⼀条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链。
三. 简述σ因⼦的作⽤.σ因⼦的作⽤是负责模板链的选择和转录的起始,它是酶的别构效应物,使酶专⼀性识别模板上的启动⼦.四. 什么是Pribnow box?它的保守序列是什么?RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后,⽤DNase I⽔解DNA,然后⽤酚抽提,沉淀纯化DNA后得到⼀个被RNA聚合酶保护的DNA⽚段,约有41-44个核苷酸对.在被保护区内有⼀个由5个核苷酸组成的共同序列,是RNA聚合酶的紧密结合点,称为Pribnow box. Pribnow区的保守序列是: TTGACA五. 简述原核⽣物和真核⽣物mRNA的区别.(⼀)原核⽣物mRNA的特征1、半衰期短2、多以多顺反⼦的形式存在3、5’ 端⽆“帽⼦”结构, 3’ 端没有或只有较短的polyA 结构。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
分子生物学 第六章
摆动性
• 反密码子与密码子之间的配对并不完全遵照 碱基互补规律，称为摆动配对。
二、tRNA
（一）结构特点 1.二级结构：三叶草结构
四环： 二氢尿嘧啶环 反密码子环 额外环 胸腺嘧啶假尿嘧啶胞嘧啶环 一臂： 氨基酸接受臂
2.三级结构——“倒L型”
（二）起始tRNA
密码子 氨基酸 表示方法
（二）延伸
1.进位 • 氨酰-tRNA 按照mRNA 分子的编码 信息进入并 结合到核糖 体A位。
（二）延伸
2.成肽
• 转肽酶催化 肽酰-tRNA 上的肽酰基 转移到A位 氨酰-tRNA 上的氨基酸 α-氨基上。
（二）延伸
3.转位
• 转位酶催化核 糖体沿mRNA 的3‘方向移动 一个密码子的 距离，使 mRNA上的下 一个密码子进 入A位，肽酰tRNA由A位移 入P位。
三、修饰
（一）磷酸化 是指在蛋白激酶的催化作用下，ATP的γ-磷酸 基被转移到蛋白质特定位点上的过程。 通常蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和在糖基转移酶的作用下，蛋白质的特定 氨基酸残基被共价连接上寡糖链的过程。 • 糖链与氨基酸的连接主要有O型连接和N型 连接两种方式。
终止密码子： 琥珀石（UAG） 赭石（UAA) 卵白石(UGA)
起始密码子： AUG（甲硫氨酸）
2.特性
(1)完整性：有始有终 (2)方向性：5’到3’ (3)连续性：不中断、无重叠 (4)简并性：多对一 (5)统一性：万物统一 (6)摆动性：：3’位可变 (7)偏爱性：使用频率各异
简并性
• 一种氨基酸具有 两个或两个以上 的密码子为其编 码，这一特性称 为遗传密码的简 并性。
一、mRNA （一）结构特点
原核 生物
真核 生物
现代分子生物学2020名词解释
第一章绪论1分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能,并从分子水平上阐明蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸之间的互作及其基因表达调控机理的学科。
2医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支,是从分子水平上研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状态下的生命活动及其规律, 从分子水平上开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。
3顺反子是编码一条多肽链的单位。
有关基因就是一个顺反子4 C值(C value :单倍体基因组中 DNA 的含量。
第二章染色体与 DNA1基因:基因是产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列 , 是决定遗传性状的功能单位。
2基因组:细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。
3C 值矛盾也称 C 值悖论,指生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象。
4DNA 的一级结构是指 4种脱氧核苷酸的连接(磷酸二酯键及其排列顺序, DNA 序列是这一概念的简称。
5DNA 的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。
6DNA 的高级结构是指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
是一种比双螺旋更高层次的空间构象。
7DNA 的半保留复制是由亲代 DNA 生成子代 DNA 时, 每个新形成的子代DNA 中, 一条链来自亲代 DNA ,而另一条链则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。
8复制子是 DNA 复制时在复制的局部将链解开,形成复制单位,称为复制子。
9 复制叉是复制时 DNA 双链解开分成二股单链‚新链沿着张开的二股单链生成,复制中形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉10 DNA 的半不连续复制是 DNA 复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的,故称半不连续复制。
11前导链是在 DNA 复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链; 合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再连成一条完整的 DNA 链为滞后链。
基础医学中的分子生物学研究
基础医学中的分子生物学研究第一章：前言基础医学是医学科学中的一门基础学科，它是研究医学领域所涉及的基本生物学问题的学科。
分子生物学则是基础医学的重要专业。
分子生物学的研究方法主要涉及对生物体内分子结构、功能和相互关系的深入研究。
该领域已为医学科学的不断发展和进步做出了重要贡献。
本文将较为系统地介绍基础医学中的分子生物学研究。
第二章：DNADNA是分子生物学研究的基础。
DNA是指脱氧核糖核酸，是所有生物体中的遗传物质。
生物体内的每个细胞都含有DNA，DNA分子结构是一个由四种氮碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成的双螺旋结构。
DNA分子内含有的基因是控制遗传信息的基本单位。
对DNA的深入研究可以揭示细胞的生命周期、疾病的发生以及疾病的治疗方法等。
例如，科学家们通过研究细胞内的DNA复制过程，发现汞、镉等致癌物质能够干扰DNA复制，可导致细胞癌变，从而为癌症的治疗提供了新的线索。
第三章：RNARNA是核糖核酸，是DNA的衍生物。
RNA在细胞内具有不同的功能，包括信息传导、蛋白质合成等。
RNA的基本结构为单链结构，其中含有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶等四种碱基。
RNA中的信息传导主要是由mRNA（信使RNA）完成的。
RNA干扰作为RNA的重要功能之一，已在诊断与治疗中发挥了重要作用。
例如，通过对肝癌组织中干扰miRNA（microRNA）的研究，科学家们发现miRNA能够通过调控肿瘤抑制因子和癌基因等关键信号通路影响肝癌的发生和发展，为肝癌的治疗开辟了新的研究方向。
第四章：蛋白质蛋白质是生命体系中最重要的分子之一，其参与的生命活动涉及几乎所有的生物学过程。
蛋白质的主要构成部分是氨基酸，各种不同的氨基酸可以形成不同的三维结构，从而决定了蛋白质的功能。
蛋白质的合成是由mRNA指导的，包括转录和翻译两个过程。
基因的变异和突变会影响蛋白质的结构和功能，导致相关疾病的发生和发展。
例如，研究表明，纤维蛋白原基因突变可导致纤维蛋白的缺失，引发血栓症，而内皮细胞生成素C受体基因的突变则可以增加胆固醇和高血压等疾病的风险。
第六章：分子生物学研究方法(下全文编辑修改
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
4. 基因定点突变技术
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨 基酸残基 对蛋白质结构功能的影响。
二、基因敲除技术
• 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通 过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行 精确的定点修饰和基因改造。
方法: • 以9~11bp作为标签（tag）＝49＝262144组合 • 串联tag并通过两端接头PCR扩增 • 扩增产物进行测序 • 每个tag通过Genebank或EST数据库进行比对 • 确认tag代表的基因表达情况
2. RNA的选择性剪接从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
2.凝胶阻滞试验 ➢ 是用于研究DNA与蛋白质相互作用的一种
特殊的凝胶电泳技术。
➢ 当DNA与蛋白质结合时，在电泳中会受到阻滞， 说明可能与某种特殊蛋白结合了。
3. DNAase足迹试验 ➢ 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被
DNAase水解，电泳中对应于结合部位没有条带。
• 常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪切。
3.原位杂交技术( In Situ Hybridization，ISH)
• 用标记的核酸探针，在组织、细胞上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手 段。
• 探针标记用同位素或地高辛、生物素荧光标记等。
地
同
高
位
辛
素
标
标
记
记
染色体原位杂交
三、蛋白质与RNA、DNA相互作用
1. 酵母单杂交系统 • 将待测转录因子cDNA与表达载体导入酵母细胞，
该基因产物如 果能够与顺式作用元件相结合，就 能激活启动子，使报告基因得到表达。
分子生物学研究方法(下)核酸分子杂交技术
增色效应（ 增色效应（二）
• 增色效应可以作为DNA变性的指标 增色效应可以作为DNA DNA变性的指标 • 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌 不同来源DNA的变化不一， DNA的变化不一 DNA经热变性后 经热变性后， 260nm的吸光度值 DNA经热变性后，其260nm的吸光度值 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 可增加40%以上，其它不同来源的DNA 40%以上 溶液的增值范围大多在20 30%之间 20－ 之间。 溶液的增值范围大多在20－30%之间。
DNA变性曲线（二）
6.DNA的复性 6.DNA的复性
• 复性概念： （1）复性概念：指变性 DNA 在适当条 件下， 件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性， DNA一般经缓慢冷却后即可复性 此过程称之为“ 退火” annealing）。 此过程称之为“ 退火”（annealing）。
2）DNA的（G+C）含量 DNA的 G+C）
• 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于 DNA分子中的 G+C）的含量。 分子中的（ DNA分子中的（G+C）的含量。 • （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm值越 G+C）含量越高， 碱基对越多，Tm值越 高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对 碱基对具有3对氢键， 只有2对氢键，DNA中 G+C） 只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能 增强结构的稳定性， 间氢键需比A 增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量， G+C）含量高的DNA DNA， 氢键付出更多的能量，故（G+C）含量高的DNA， 其变性Tm也高。 Tm也高 其变性Tm也高。
专业基础课-《分子生物学》课程教学大纲(普通班)
《分子生物学》课程教学大纲适用对象：本科药学专业中文班（学分： 3 学时：54 ）一、课程的性质和任务：分子生物学是研究生物基因表达规律、探索生命奥密的一门基础理论科学，也是研究基因的结构和功能的科学，也是高等院校生物学专业必修课程之一，面向生物技术专业和生物科学专业。
本课程应在无机及分析化学、有机化学、生物化学等课程之后开设，同时又是动物生理学、植物生理学、遗传学、细胞生物学、微生物学等课程的专业基础课。
分子生物学是生物学科发展最快的学科，在推动二十一世纪生物技术产业的崛起、推动国民经济持续高速发展等方面均有重要的作用。
通过对本课程的学习，使学生掌握分子生物学的发展史及研究内容；DNA的结构和功能；基因组的特点及其研究方法；DNA的复制和损伤的修复；RNA的生物合成和剪接加工；蛋白质的生物合成；分子生物学的基本研究方法和技术手段；原核生物和真核生物基因表达的调控的等内容。
理论教学36学时，实验教学18学时。
通过本课程学习，使学生掌握分子生物学的基本原理和实验技能，具备从事与分子生物学相关学科的科研工作的初步能力，并为后续课程的学习打好坚实的基础。
二、教学内容和要求（含每章教学目的、基本教学内容和教学要求）：第一章绪论【教学基本要求】掌握分子生物学的概念和研究范畴，熟悉分子生物学的发展历史。
【教学具体内容】一、分子生物学的概念二、分子生物学研究的内容基因与基因组的结构与功能；DNA的生物合成、修复和重组；RNA的生物合成和转录产物的加工；蛋白质的生物合成；基因表达的调控；穿插介绍相关的研究技术。
三、分子生物学的发展和展望人类对DNA和遗传信息传递的认识阶段；重组DNA技术的建立、发展和应用；结构基因学和功能基因学的发展现状和发展趋势。
第二章染色体与DNA【教学基本要求】掌握DNA的一二三级结构、性质和功能；熟悉原核生物和真核生物基因组的特点，掌握DNA复制过程及DNA变性复性等概念及影响因素。
【教学具体内容】第一节染色体和DNA的结构一、DNA的一级结构：是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了DNA分子的化学构成。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。
这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。
以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。
3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。
4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。
5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。
6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。
7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。
8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。
9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。
分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。
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基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲
除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除 细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型 基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。
噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母
细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常
用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛。
图6-9 用取代型（a）或插入型
（b）载体进行完全基因敲除实验
图6-10 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同 源重组的细胞
正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA
功能最关键的外显子中，或通过同源重组法 置换靶基因的功能区。 负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段 外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培 养基上生长。如果细胞中发生了随机重组， 负向选择基因就可能被整合到基因组中，导 致细胞死亡。
并有效地定位目标mRNA。
RNAi作用机 制示意图。
由siRNA中的反义链参与指导合成被称为 RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体， 再由RISC介导切割目的mRNA分子中与 siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶 基因表达的功能。
图6-6 寡核 苷酸介导的 DNA 突 变 技 术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技 术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点 突变。
重 叠 延 伸 诱 变 法 示 意 图
图6-8 大引物诱变法示意图
6. 2 基因敲除技术
6. 2. 1 基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的
8、Gateway大规模克隆技术的原理及基本
过程。
9、基因图位克隆法的原理和过程。
10、说出基因操作与基因工程技术的异同。
11、说出蛋白质组学的基本概念和主要技术手
段，说出基因组与蛋白质组的主要差别。
12、蛋白质免疫印迹实验的原理和过程。
第 六 章
分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术
6. 1. 3 原位杂交技术
6. 2. 2 高等动物基因敲除技术
真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建 重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外 源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组，将重组载体中的DNA序列整 合到内源基因组中并得以表达。
图 6-12 模式动物小鼠中 完全基因敲除的主要技术 策略与应用。
表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编
码序列。
现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先
从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该
基因的功能。
基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通
过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组， 进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性 强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传 等特点。
原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，
经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核
及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段， 分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等） 标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存
Center. ห้องสมุดไป่ตู้he Plant Cell 20: 1482-1493.
荧光原位杂交
(fluorescence in situ hybridization，FISH). 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶 染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相 耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
1、 DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端
的主要生物学意义是什么？
2 、 cDNA合成时的方向其主要改进过程。
4、SNP的概念、分类与主要检测方法。
5、请说出蓝白斑筛选的分子机制。
6、5’和3’RACE的主要技术流程。
7、PCR的主要应用途径及基本原理。
显微注射命中率较高，技术难度相对大些。
电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技
术及其应用
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解 细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细 胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源 于安德鲁〃法尔1998年在《自然》杂志上的论 文。
• 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与 之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA） 的降解。
• 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）
的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以
上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干
扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），
在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可
通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物 做出定性定量分析。
mRNA 的 互 补 链 ， 杂交信号集中于 纤维细胞中。
负对照， mRNA 的 同义链 , 无杂交 信号。
正对照，UBQ10 杂交信号遍布于 整个胚珠。
Ji S.J. et al. (2003) Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development by subtractive PCR and cDNA array. Nucleic Acids Res. 31: 2534-2543.
人肌糖原磷酸 酶基因在11号 染色体的定位 结果。
6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis).
通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所
编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基
酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配 体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特 征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
Expression
pattern of BARD1
In Situ hybridization
Han P, Li Q, Zhu YX. (2008) Mutation in the
Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases
WUSCHEL Expression from the Organizing