高效石油降解菌的筛选及初步鉴定

结果
革兰氏染色
-
MR 实验
-
V P 实验
-
柠檬酸利用
-
淀粉产生实验
-
淀粉水解实验
+
糖发酵实验
不产酸 ,不产气
明胶水解实验
+
尿素水解实验
+
吲哚实验
-
H2O2 酶
+
氧化酶
+
C 源的利用
-
N 源的利用
+
脱氨酶
+
结合菌株生理生化特征 、菌落形态特征和菌体显 微形态 (表 1) ,参照文献 [ 6 ] ,初步鉴定菌株 X21 属于 节杆菌属 ( A rt h robacter sp1 ) 。 21 5 讨论
6 4
2009 ,Vol. 26 No. 7 化 学 与 生 物 工 程
Chemistry & Bioengineering
高效石油降解菌的筛选及初步鉴定
王伟平1 ,李 伟2 ,邱雁临1 ,张华山1 ,彭晓斌1 (1. 湖北工业大学生物工程学院 ,湖北 武汉 430068 ; 2. 武汉市汉江石油物资技术开发有限责任公司 ,湖北 武汉 430051)
参考文献 : [ 1 ] Mark A S , J ames S B , Cheryl A P , et al1 Evaluation of t wo co m2
mercial bioaugmentation p roduct s for enhanced removal of pet ro2 leum f ro m a wetland [J ] . Ecological Engineering ,2004 , 22 (425) Hale Waihona Puke Baidu 2632277 . [ 2 ] 李宝珍 ,仉磊 ,林壬子 ,等. 降解石油微生物菌种的筛选及降解特 性[J ] . 中国环境科学 , 2003 , 23 (2) : 1572161. [ 3 ] 王辉 , 赵春艳 , 孙军德 ,等. 石油污染土壤中细菌的分离筛选[J ] . 土壤通报 ,2005 , 36 (2) : 2372239. [ 4 ] 高国良. 紫外分光光度法测水中石油类物质的有关问题探讨[J ] . 新疆环境保护 , 1996 , 18 (3) : 37239. [ 5 ] 吴玉新. 紫外分光光度法测定污水中油含量的研究 [J ] . 石化技 术 , 1998 , 5 (2) : 1122114. [ 6 ] 东秀珠 , 蔡妙英. 常见细菌鉴定手册 [ M ] . 北京 : 科学出版社 ,
摘 要 :经过以石油烃为唯一碳源的选择性培养基平板初筛和三角瓶发酵复筛 ,采用紫外分光光度法测定石油降解 率 ,从江汉油田和冀东油田石油污染的土壤和水体中 ,筛选出有降解石油能力的微生物 9 株 。其中 3 株细菌 ( X21 , X22 , X23) 降解石油能力较高 ,X21 菌株的石油降解率最高达 641 28 %。根据形态学观察和部分生理生化特征初步鉴定 ,该菌 为节杆菌属 ( A rt hrobacter sp . ) 。
g ,氯化钠 5 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水 1000 mL ,p H 值 71 2 ～71 5 。
真菌分离及斜面培养基 :马铃薯 200 g 煮出液 ,蔗 糖 20 g ,琼脂 15～20 g ,蒸馏水 1000 mL ,p H 值自然 。
放线菌分离培养基 :可溶性淀粉 20 g , KNO3 1 g ,
组分往往需要不同的细菌来分解 ,将不同细菌的基因 分离出来 ,集中到一种细菌内 ,从而得到了“超级菌”, 其分解石油的速度比普通细菌快得多 ,净化石油污染 的能力明显提高 。
3 结论
从江汉油田和冀东油田污染的土壤和水体中 ,筛 选出有降解石油能力的 9 株细菌 ,其中菌株 X21 、X22 、 X23 的石油降解率均超过了 60 % ,降解原油的效果较 好 。菌株 X21 除油效果最好 ,对其进行生理生化特征 鉴定 ,结合菌落形态特征和菌体显微形态 ,初步鉴定属 于节杆菌属 ( A rt h robacter sp . ) 。
关键词 :石油污染 ;紫外分光光度法 ;石油降解菌 ;降解率 中图分类号 : X 172 文献标识码 :A 文章编号 :1672 - 5425 (2009) 07 - 0064 - 03
在石油的开采与运输中常伴随有石油的泄漏 ,造 成环境污染 。首先 ,石油进入土壤后难于去除 ,残留时 间长[1] ,使土壤中碳源大量增加 ,直接导致碳氮比失调 以及酸碱度变化 ,破坏土壤结构 ,从而影响土壤的疏松 程度和通气状况 ,对土壤微生物和土壤植物生态系统 , 甚至地下水都产生危害 ;其次 ,由于石油的主要成分是 烷烃 、苯 、甲苯和二甲苯等多种复杂芳香烃[2] ,如进入 食物链会造成人体损伤 ,给油田及周围的生态带来严 重的环境问题 ,因此治理石油污染势在必行 。
为进一步提高菌株的石油降解率 ,拟从以下几个 方面进行深入研究 : (1) 优化培养条件 ,如培养温度 、溶 氧量 、培养液 p H 值 、摇床转数等 ,以使筛选出的细菌 大量繁殖 ; (2) 选择几株合适的细菌优化组合 ,但要考 虑其相互之间是否产生拮抗 ; (3) 可采用紫外或化学方 法对筛选出的菌株进行诱变[7 ,8] ,通过筛选平板上透 明圈直径与菌落直径的比值大小来说明其降解能力是 否有所提高 ; (4) 构建“超级菌”[9] 。由于石油中的不同
21 4 菌株生理生化特征鉴定结果 对除油效果最好的 X21 菌株进行生理生化特征鉴
定 ,结果见表 3 。
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乳白色
杆状
A22 表面湿润光滑 ,边缘整齐 ,圆型 ,不透明 粉色
短杆状
G21
透明干燥 ,边缘不齐
乳黄色 短杆状
G22
表面湿润 ,透明
乳黄色
球状
D
褶皱干燥 ,边缘不齐
乳白色 长杆状
E
表面湿润光滑 ,边缘整齐
乳黄色 长杆状
图 1 原油标准曲线 Fig. 1 The standard curve of crude oil
表1
菌落及菌体形态观察结果
Tab. 1 Observation results for colony and cell morphology
编号
菌落形态
菌落颜色 菌体形状
X21
表面干燥 ,褶皱状边缘隆起
白色
短杆状
X22
表面湿润粘稠 ,透明
绿色
杆状
X23
表面湿润光滑 ,易挑取
乳白色 短杆状
A21
表面光滑 ,边缘平整
取 3 g 含油土样或 1 mL 含油水样 ,接入 250 mL 富集培养基 ,30 ℃摇床振荡培养 48 h 。取 01 2 mL 富 集液涂布到筛选培养基平板 ,37 ℃恒温培养 48 h 。挑 取生长较好 、菌落较大的菌株分别在细菌 、真菌和放线 菌分离培养基平板上分离 、纯化 、保种 ,纯化后的菌种 在原油培养基平板上驯化 3～4 次 ,获得石油降解菌 种 。观察菌株的生长情况 、菌落特征和菌体形态 。
表2 Tab. 2
菌体生长及其对石油的降解情况 Growth of bacteria and their effects on degradation of oil
编号
X21
X22
X23
A21
A22
G21
G22
D
降解后残油量
-
-
-
+
+++++
++
+++
+
菌液浑浊
+++
++
++
+++
+
++
++
+
石油降解率/ %
%
11 4 菌株初步鉴定
参照文献[ 6 ] ,观察石油降解率最高的菌株形态并
进行生理生化实验 ,对照形态和生理生化特征进行初
步鉴定 。
2 结果与讨论
21 1 原油标准曲线( 图 1)
21 2 石油降解菌株的初筛 从筛选培养基中挑菌分别接种到真菌 、细菌和放
线菌分离培养基平板培养 。结果发现 ,真菌平板上主 要有两种菌落 ,一种呈乳白色 ,表面光滑 ,正面凸出 ,边 缘完整 ,命名为 J21 ;另一种呈灰色 ,表面粗糙 ,较平整 , 边缘完整 ,命名为 J22 ,该真菌在筛选平板上没有食油 圈形成 ,表明虽然该菌能利用石油为唯一碳源生长 ,但 分解石油的能力不明显 。放线菌平板没有菌落生长 。 细菌平板上经划线分离后分出食油圈明显的菌株 9 株 ,分别记为 X21 、X22 、X23 、A21 、A22 、G21 、G22 、D 和 E ,将它们分别接种到斜面培养基上保藏 ,供复筛 。观 察单菌落的菌体形态和颜色变化 ,结果见表 1 。
液 。以石油醚为空白对照样 ,在 228 nm 波长下测定
吸光度 ,绘制标准曲线 。
11 31 3 石油降解率的测定[5]
用紫外分光光度计在 228 nm 波长处测得样品的
OD 值 ,对照标准曲线查得含油量 ,按下式计算出石油
降解率 。
石油降解率
=
发酵液含油量 - 培养基原含油量 培养基原含油量
×100
641 28
601 02
621 03
511 09
101 56
101 23
81 64
511 09
注 :石油降解完全用“ - ”表示 “, + ”依次增加代表残油量依次增加 ;菌液清亮用“ - ”表示 “, + ”依次增加代表菌液浑浊度增加
E 油聚集成球状
01 00
从表 2 可知 ,菌株 X21 、X22 、X23 的石油降解率较 高 , 均 超 过 了 60 % , 其 中 X21 石 油 降 解 率 高 达 641 28 % ,其它菌的降解率则较低 ,降解效果较差 。
11 21 2 复筛 将初筛得到的菌株分别接入发酵培养基 , 30 ℃、
150 r ·min - 1 摇床上培养 3 d ,观察石油降解情况 。每 个筛选摇瓶中加 10 mL 石油醚萃取 ,取上清液 ,用石
收稿日期 :2009 - 03 - 10 作者简介 :王伟平 (1972 - ) ,女 ,湖北当阳人 ,博士 , 副教授 ,主要研究方向 :发酵工程 。E2mail :wang1wei1ping1 @163. co m 。
从表 1 可知 ,所筛选菌株颜色各异 ,有白色 、乳白 色 、乳黄色 、绿色和粉色 。挑取菌细胞均匀涂于载玻片 上 ,用 10 ×100 油镜观察菌体形状 ,发现菌体形状有杆 状 、短杆状 、球状和长杆状 。 21 3 石油降解菌株的复筛
对初筛得到的 9 株菌株进行了复筛 ,其对石油的 降解效果见表 2 。
11 3 石油降解率的测定
11 31 1 波长的选择
配制浓度为 100 mg ·L - 1 原油溶液 ,在紫外分光
光度计上扫描 ,得出最大吸收峰处波长为 228 nm 。
11 31 2 标准曲线的绘制[4]
以石油醚为溶剂 ,依次配制 10 mg ·L - 1 、20 mg ·
L - 1 、30 mg ·L - 1 、40 mg ·L - 1 、50 mg ·L - 1 的原油溶
6 6
王伟平等 :高效石油降解菌的筛选及初步鉴定/ 2009 年第 7 期
表3 Tab. 3
X21 菌株生理生化特征鉴定结果 The verifying results of physiological and biochemical characteristics of strain X21
生理生化实验
U V22550 型紫外分光光度计 ,日本岛津分析仪器 公司 。
菌种筛选及富集培养基 : 原油 2 g , NaCl 01 5 g , (N H4 ) 2 SO4 01 1 g , MgSO4 ·7 H2 O 01 025 g , NaNO3
01 2 g ,Na H2 PO4 01 5 g ,p H 值 71 2 ,水 1000 mL 。 细菌分离及斜面培养基 :蛋白胨 10 g ,牛肉膏 41 5
NaCl 01 5 g , K2 H PO4 01 5 g ,MgSO4 01 5 g , FeSO4 01 01 g ,琼脂 20 g ,蒸馏水 1000 mL ,p H 值 71 2～71 5 。
发酵培养基[3] : NaNO3 3 g , K2 H PO4 1 g , MgSO4 ·7 H2 O 01 5 g , KCl 01 5 g , FeSO4 ·7 H2 O 01 01 g , CaCl2 01 002 g ,石油烃 1 mL ,蒸馏水 1000 mL ,p H 值 71 2～71 5 。 11 2 方法 11 21 1 初筛
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王伟平等 :高效石油降解菌的筛选及初步鉴定/ 2009 年第 7 期
6 5
油稀释 50 倍 ,测定各菌株石油降解率 。
采用一定的物理或化学手段处理石油污水可以极 大地减少对环境的污染 ,但效果仍不理想 。因此 ,作者 从江汉油田和冀东油田石油污染的土壤和水体中富集 分离石油降解菌 ,以期能为石油污水的处理提供基础 资料 。
1 实验
11 1 材料 、仪器与培养基 土壤采自江汉油田和冀东油田磕头机旁含油土壤
(采样方法 :用小铁锹除去地面浮土后 ,取地表或地下 10 cm 的土壤样品) 。水样品为江汉油田磕头机旁废 水和冀东油田高一联隔油罐出水 。原油 (石油烃) 由冀 东油田提供 。