荧光定量PCR的原理及其应用

d.NTPs Taq酶
SYBR Green I
反应组分
Taq
l
ID
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
ID Taq
ID ID
Taq ID ID
5’
延
3’
伸Байду номын сангаас
5’
l
3’
l ID ID ID l l
l ID
Taq 5’
3’
检测激发的荧光
Taq
ID


插入染料法相对成本低 不需要设计探针，通用性强 对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增） 不能做多重PCR
应用
荧光定量PCR
医疗方面的部分应用（1）：
临床检测：
应用
疾病的临床早期诊断 如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相 关的疾病以及肺结核等等 疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案
了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况
医院、血站及防疫站的确诊
荧光定量PCR
医疗方面的部分应用（2）： 遗传病诊断 ：
应用
肿瘤抑制基因高甲基化而引起基因沉默是胃肿瘤发生 的一个重要机制



甲基化一般发生在基因的启动子区CpG中的C核苷酸
SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling-1)高甲基化与 胃肿瘤的发生具有密切联系
荧光定量PCR
研究方法
胃癌患者血清DNA提取 （蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、乙醇）
应用
等位基因检测
多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测
荧光定量PCR
医疗方面的部分应用（3）：
应用
肿瘤诊断 ：
肿瘤相关基因表达的检测 ：包括癌基因 抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因
肿瘤标志物 如癌胚抗原、同功酶、抗体、 激素、细胞因子、受体等
肿瘤耐药基因（MDR）
荧光定量PCR
荧光定量PCR
应用
癌症患者血清中SOCS-1 高度甲基化
此方法诊断具有非侵入 人体优点 SOCS-1可作为胃癌早期 诊断的指标之一
荧光定量PCR
• 基因表达水平研究
应用
– 基因的绝对表达量（微生物检测、环境监测） – 标本间基因的差异表达（病理相关、芯片验证）
• 基因型研究
– 基因单碱基变化（SNP、mutant） – 基因的碱基修饰（甲基化等）
The standard curve of (in vitro methylated DNA, IVD) determined at 77°C
荧光定量PCR
研究结果
应用
a
In vitro methylated DNA b Results from duplicate experiment c Amount of methylated SOCS-1 as determined by Ct value
荧光定量PCR
杂交探针方法
• TaqMan 探针 • 分子信标探针（Molecular Beacons）
原理
TaqMan探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
R
d.NTPs Taq酶
反应体系
Q
Probe
Taq
l
R
Q
变
性
Q
5’
R
3’
退 火
R
Q
5’
Taq
3’
1. 链取代 2. 水
R Q
5’
Taq
Tumor RNA
0.018 0.011 / 0.018
Graph
荧光定量PCR
ERBB2的表达差异
2 1.8 1.6 1.4 1.2
应用
Relative Expression
1
0.8
0.6 0.4 0.2 0
Healthy Tissue
Carc. Tissue
荧光定量PCR
胃癌早期诊断之 SOCS-1高甲基化的检测
应用
荧光定量PCR
研究方面的部分应用（3）：
应用
动物学方面：
动物疫情监测
新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究
转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研 究及早期筛选
荧光定量PCR
其他方面的部分应用（1）： 进出口检验相关 ： 动物检疫，如各种动物流行病 植物检疫，如各种植物流行病 有害动物，特别是昆虫
X=X0(1+Ex)n
原理
n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X=log X0 (1+Ex)n
log X0= (- log(1+Ex) )*n+ log X
log X0= (- log(1+Ex) )*C(t) + log Xc(t)
初始模板的Log10值与Ct值呈线性关系！
R
5’ 3’
解
Taq
5’
5’ 3’
3. 聚
合
l Taq
5’
R
5’ 3’
4. 检测荧光
扩增特异性强 可以做多重检测
成本较高
Molecular Beacon
发夹结构
退火时与靶片段结合 引物延伸时被切断
More…
荧光定量PCR
• • • • • • 医疗领域的应用 科学研究方面的应用 公安系统内的应用 动植物检疫 考古学方面的应用 ……
荧光定量PCR
应用
使用TaqMan探针进行双通道荧光定量
Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针
荧光定量PCR
ERBB2 的表达（正常组织vs. 肿瘤组织）
应用
目标基因：ERBB2 oncogene 看家基因：GAPDH 模板 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线
3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环3
3’
5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
3’ 3’
8个拷贝
3’
3’ 3’
PCR反应模式
Theoretical
Log Target DNA
Real Life
Cycle #
同一样品96复孔的实验结果
荧光定量PCR
原理
常规PCR 电泳鉴定
缺憾
无法对初始模板精确定量 无法实时监测扩增情况 跑胶繁琐、易污染
荧光定量PCR
应用
荧光定量PCR
应用
荧光定量PCR
ERBB2 扩增曲线
PMT1-FAM detection- ERBB2
应用
PMT2-VIC detection- GAPDH
荧光定量PCR
Copies ng/ µl Total RNA
应用
Tumor RNA 2130 2492 136000 130800
双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线； 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理； 标本间靶基因的表达水平分析 2 -ΔΔc(t) 法
标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t) =C(t)m － C(t)n
标本间ΔC(t) 比较： ΔΔc(t)＝ ΔC(t)1 － ΔC(t) 2 2 -ΔΔc(t) 计算
荧光定量PCR
相对定量
原理
无需制备标准品(2 -ΔΔc(t) 法)，需要内参照基因，注 意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）
差异表达分析，芯片结果验证等
荧光定量PCR
原理
• 插入染料法
SYBR Green I
• 杂交探针法
TaqMan
插入染料方法的原理
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
Healthy RNA ERBB2 1095 1052 95500 85730
GAPDH
荧光定量PCR
Copies ng/ µl Total RNA
应用
ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 0.0115
荧光定量PCR
研究方法
亚硫酸氢钠处理的血清DNA
94°C 6min 94°C 10sec
定量PCR (SYBR)
应用
64°C 25sec 72°C 25sec
40cycles
77°C 10sec
Melting curve analysis
结果统计、临床意义分析
荧光定量PCR
研究结果
应用
Melt curve of real time MSP analysis of SOCS-1 gene
• 相对定量
双标准曲线法 2 -ΔΔc(t) 法
荧光定量PCR
绝对定量
原理
通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线
样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度 • 精确定量 • 大范围拷贝数样品同时检测 –100 — 1010 • 省时有效 临床检测，转基因检测，环境监测等
荧光定量PCR
相对定量
原理
设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因 对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标 基因拷贝
Template
50~200ng
统计分析
扩增HBV核心抗原core 基因
荧光定量PCR
检测结果
应用
特异性强：使用了Taqman probe 灵敏：检测下限达到了10 copies，
Amplification of standards
荧光定量PCR
检测结果
应用
血清中HBV含量比精液中高出两个数量级

Melting Curve analysis
• 逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与 荧光值的关系曲线
-dI
荧光强度
dT
Tm
Tm
温度
Tm值：一半DNA解链时的温度
Solve the non-specific product
优化条件
更换引物
权宜之计
Melting curve
40 cycles 95 ℃ 10sec 60 ℃ 15sec 72 ℃ 30sec 80 ℃ 10sec detection
More…
We need to decide what to start?
• 决定实验方案（绝对定量？相对定量？） 实验目的 • 决定选用实验方法 (SYBR green？TaqMan?) 检测基因数、样本数 成本核算
We need Kits?
定量PCR试剂 • SYBR Green I Mix • TaqMan Mix 配套耗材 • Tubes • Strips • Plate
荧光定量PCR
设定标准品，绘制标准曲线
原理
106
105
104 103 102 10
荧光强度---循环数 曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标 准曲线
荧光定量PCR
原理
通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量
unknown Ct值
104
103
荧光定量PCR
两种定量方法
• 绝对定量
标准曲线法
原理
荧光定量PCR
原理
荧光定量PCR
在体系中引入荧光染料 实时检测 扩增阶段： 指数期 平台期
荧光定量PCR
C(t) value Threshold line
原理
阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准 C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数
荧光定量PCR
荧光定量PCR
Outline
• 荧光定量PCR的原理 • 荧光定量PCR应用
PCR 反应过程
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
Taq
Taq
5’
延
3’
伸 复
重
3’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环2 4个拷贝
3’
3’ 3’
3’ 3’ 3’
• 修饰非甲基化CpG为UpG
• 甲基化位点不修饰
应用
亚硫酸氢钠处理
DNA template
定量PCR 体系

SYBR supermix
Primers
针对未经修饰改变的启动子序列
以 In vitro methylated DNA(IVD)为阳性对照（标准品） 以非甲基化的胃癌细胞系KATO III为阴性对照 以6个年龄、性别匹配的正常人血清做统计学分析
研究方面的部分应用（1）： 分子生物学方面：
应用
研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响
比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异
DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究
荧光定量PCR
研究方面的部分应用（2）： 植物学方面： 转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化 转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化
应用
食品检测，如各种有害病原微生物，如 病毒、细菌、支原体 转基因植物检验，如转基因大豆、西红 柿等
荧光定量PCR
其他方面的部分应用（2）：
应用
公安系统相关 ：
个人身份鉴定
物证的各种鉴定
人种的鉴定 考古方面 物种分类
荧光定量PCR
乙肝病毒HBV检测

应用

据统计，目前中国有10~15%的人感染有 HBV病毒 人工受精前男性HBV检测 患者血清、精液的HBV检测
荧光定量PCR
检测方法
患者血清、精液 DNA的提取
酚/氯仿、试剂盒抽提
应用
含core gene不同浓度梯度 质粒为标准品
50°C 5min
TaqMan Probe 0.25uM Primer PCR buffer 0.9uM 1х
95°C 10min 95°C 15sec 40cycles
60 °C 40sec