第二章_生产中常用菌种的分离、选育和保藏

2. 氨基酸生产有关的微生物 20 世纪 50,60 年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个 转折点。 代谢控制发酵是指用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度 地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。 谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属的棒型细菌。 L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、微杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具 有下述共同特性：①细胞形态为短杆至棒状；②无鞭毛，不运动；③不形成芽孢；④革兰氏 阳性；⑤要求生物素（利用石蜡为碳源的要求硫胺素）;⑥在通气培养条件下产生大量 L－谷 氨酸。此外，其他细菌、放线菌和真菌中的一些属种也有产 L－谷氨酸的菌株，但产酸率较 低。 其它氨基酸生产菌：常规菌种—主要是对上述产 L－谷氨酸的优良菌株进行人工诱变后选 育出的各种突变株；工程菌—大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。 3．食品酶制剂生产有关的微生物 常用的食品酶制剂有： 糖类酶：淀粉液化酶、淀粉糖化酶、葡萄糖水解酶、葡萄糖异构酶等 (淀粉的液化、糖化、 异构化的相关 )。 其它酶：蛋白酶、凝乳酶、脂肪酶、果胶酶等。 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到 FDA 的批 准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 常见酶制剂生产菌： a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌 蛋白酶：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌；黑曲霉、米曲霉、米根酶；
境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。 2.目的微生物的富集
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富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，增加筛选几率。 富集的方案：
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定向培养：采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息时，只能通过随机分离的办法。
定向培养的富集方法： 一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微 生物在种群中占优势（比生长速率） 。常用的手段包括：底物 、pH 条件 、培养时间、培养 温度。 例如：碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳 源，选择利用这唯一碳源才能大量正常生长的微生物，而淘汰其它微生物。 3.菌种的筛选
为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群， 特别是分离那些在唯一微环境区 域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。需要注意的问题有： � 采样时应尽可能保持相对无菌； � 所采集的样本必须具有某种代表性； � 采好的样本必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态 参数等； � 应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的； � 采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于 4℃下，但贮存时间不宜过长。这是 因为一旦采样 结束，样品中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环
第二节 目的微生物的分离
一、菌种的来源 � 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； � 从大自然中分离筛选有生产能力的微生物菌种。 下面简单介绍几个国内外较大规模的菌种保藏中心： 美国典型微生物菌种保藏中心, American Type Culture Collection(ATCC) ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种 保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等 的研究。 该中心保藏有藻类、细菌、细胞和杂合细胞、丝状真菌和酵母、植物组织、种子、原生动 物 、动物病毒、衣原体和病原体、植物病毒 1563 种。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴 定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 荷兰微生物菌种保藏中心 （CBS） CBS 是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。 主要从事菌种保藏方法、分类 学、分子生物学、医学微生物学等的研究。该中心保藏有真菌 35000 株、酵母 5500 株。 德国微生物菌种保藏中心(DSMZ) 是德国的国家菌种保藏中心。该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物 细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。 该中心是欧洲规模最大的生物资源中心， 保藏有细菌 9400 株， 真菌 2400 株， 酵母 500 株， 质粒 300 株，动物细胞 500 株，植物细胞 500 株，植物病毒 600 株，细菌病毒 90 株等。该中 心保藏的菌种可出售。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。 美国农业研究菌种保藏中心 ( NRRL) NRRL 是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、 应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、 普通微生物、分类学的研究。该中心保藏有细菌 10500 株，真菌 45000 株，酵母 14500 株， 放线菌 9500 株。 该中心提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。
第三节Байду номын сангаас菌株选育、分子改造
菌株选育的目的在于防止菌种退化、解决生产实际问题、提高生产能力、提高产品质量和 开发新产品。 菌株选育的方法： 基因突变：自然选育、诱变育种 基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程技术 基因的直接进化：点突变、易错 PCR、DNA Shuffling
一、自然选育 1.自然选育的概念 自然选育： 在生产过程中， 不经过人工处理， 利用菌种的自然突变(Spontaneous Mutation) 而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。自然突变的机率为 10-8～10-9。 自然突变有两种情况，一种是生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下 降，这种突变成为负突变。另一种是生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。 2. 自然选育在工业生产上的意义 高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况 称为回复突变。这是发酵生产不希望发生的。 自然选育虽然正突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。经常进行自然选育工 作，可以淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，稳定和提高发酵产量。 3. 自然选育操作步骤 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。操作步骤包括： 单细胞(孢子)悬液的制备 －→平板分离 －→挑选单菌落(注意形态的观察) －→发酵试验 二、诱变育种 1、定义 通过各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变的频率，扩大变异范围，从中选出具有 优良特性的变异菌株的育种方法。 2、特点 基因突变频率高（10-3－10-6） ，而自然突变仅 10-9； 速度快、收效大、方法简便； 是国内外提高菌种产量、性能的主要手段； 工作量大，缺乏定向性。 (一)诱变剂的种类与选择 1. 物理诱变剂 � 射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子 2. 化学诱变剂 � 碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等。 化学诱变剂，比物理诱变剂有效，而且很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危害性大。 诱
3. 遗传性能要相对稳定。 4. 不易感染其它种微生物或噬菌体。 5. 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） 。 6. 生产特性要符合工艺要求。 三、已工业化产品生产菌的介绍 1. 抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：
变剂的分类如下表：
3. 诱变剂的选择 （1）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，回复突变率高，效果不大。 （2）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯 常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 （3）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 （4）紫外线仍十分有效。但会造成不可回复的缺失突变，还会影响邻近基因的性能。 （二）诱变育种方案与步骤 诱变的三个环节包括突变的诱发，突变株的筛选，突变高产基因的表型筛选。步骤如下： 1.出发菌株的选择 � 选择有一定生产能力的菌株。或已经初步诱变过的菌株，对诱变处理较敏感，效果好。 � 出发菌株选 2～3 株，在处理比较后，取更适合的出发菌株作继续诱变。 � 尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞。 2.菌悬液的制备 3.诱变处理 制备单细胞和单孢子菌悬液。
二、菌种分离思路 菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、 菌种的特性， 采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。此外实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 菌种分离的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。 菌种分离需解决的问题：如何使样品中所含微生物的可能性最大！ • 三、菌种分离与筛选的步骤 菌种分离与筛选主要有以下 5 个步骤： 定方案：查阅资料，了解菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发 酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适 pH 值、提取工艺等。 1. 采样时要注意的问题 如何在后续的操作中使这种可能性实现！
中国普通微生物保藏治理中心 China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)
CGMCC 是我国保藏微生物种类最多、数量最大、研究力量最强的保藏中心。中心主要从 事微生物菌种保藏技术，微生物分类学的研究。同时提供分离、收集、保藏、鉴定、交换和 供给各类微生物菌种的服务。主要采用超低温冻结和真空冷冻干燥保藏法。 保藏菌种数高达 12583 株， 其中细菌 2263 株， 放线菌 1360 株， 真菌 5860 株， 酵母菌 2100 株，其它 600 株，来自国外的各类专利培养物 400 株。 中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 治 理 中 心 China Center of Industrial Culture Collection(CICC) CICC 是中国国家级工业微生物菌种保藏中心，也是国际菌种保藏联合会（WFCC）和中 国微生物菌种保藏治理委员会成员之一，负责全国工业生产与研究应用微生物菌种的收集、 鉴定、保藏与供给，微生物菌种保藏技术与应用技术的研究与培训等。 该中心保藏国内外各类工业微生物菌种 1750 余株， 包括细菌 380 余株， 酵母菌 750 余株， 丝状真菌 620 余株