第7章 酶的定向进化-2010

一

提高酶的催化活性 1994年, Stemmer 使β－内酰胺酶对新的底物 cefotaxime 的活性提高了32000 倍．
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂

2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
二 DNA改组（DNA Shuffling)
1994，Stemmer等首次提出体外重组技术，又称有性 PCR(sexual PCR) 、或分子杂交(moleular breeding)
优点：以用重组的方法将存在于许多突变体当中的有益突变 快速积累，可以删除个体中的有害突变和中性突变． 缺点：改组过程中伴随的较高点突变频率会严重阻碍正突变 组合的发现。
第七章 酶的定向进化
内容


概述 定向进化的特点 突变技术 筛选技术 定向进化的应用
概述
天然酶应用过程中出现问题（改造动机） 1 天然酶的稳定性差、活性低使催化水平很低、 缺乏有商业价值的催化功能； 2 越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然界 中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程 根源: 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。而自然 的酶只能满足自然界中生命体（而非人类社会） 的需要

6 核糖体和mRNA展示
第四节 定向进化的应用

提高酶分子的催化活力


提高酶分子的稳定性
提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进 化

对映体选择性的定向进化
1 提高酶的催化活性

1994年, Stemmer 使β－内酰胺酶对新的底物 cefotaxime 的活性提高了32000 倍．
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
3）用透明圈筛选突变酶


淀粉酶，蛋白酶等分泌后会在平板上产生水解透 明圈 一般酶活越大，水解圈越大。
2 有灵敏性高、方法简便的优点，在 高通量筛选中被广泛应用，该方法可以使用很稀 的底物浓度和极少量的催化剂进行检测。
3 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋 白的形式表达并展示在噬菌体表面，利于蛋白酶 的催化或蛋白分离
结果
实施菌种
在60-50℃酶半衰期 耐热脂肪 增加200倍 芽孢杆菌 在60％二甲基亚砜 中活力增强170倍 对cefotaxime的抗 性增加32000倍 活力增加60-150倍 枯草杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
胸苷激酶 β-半乳糖苷酶 砷酸脱毒途径
活力增加43倍 活力增加66倍底物 特异性增加1000倍 抗性增加12倍

Tuck Seng Wong,* Frances H. Arnold, Ulrich Schwaneberg, BIOTECH. & BIOENG., VOL. 85, NO. 3, FEBRUARY 5, 2004
三 改变对映异构体特异性
2001年，Reetz小组用易错PCR将脂肪酶在只有一 个突变点的低突变率的情况下其对映选择性提高到ee ＝81%，当将易错PCR和定点饱和突变相结合在 “hot spots”上得到了进一步的提高，有几个突变酶 的ee%达到了90-94%。 Arnold 等利用饱和突变定向技术进化Ｐ４５０Ｂ Ｍ３成功获得了几个突变酶，这些突变酶对短链烷烃 末短羟基化的立体选择性［(R)- or (S)-］从83% 提 高到 95%。
三 基因家族重排技术



该重排技术和DNA重排 技术大致相同。 区别在于基因家族重排 所用同源基因重排，而 后者使用重同一基因易 错pCR获得的点突变进 行重排。 同源性高，获得杂合体 几率低
第三节定向进化的筛选技术

在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选 择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实 验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容 量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某 一方向的进化速度。
PCR反应循环
94℃
变性-提供单链模板
55℃
退火-接上杂交引物
72℃
延伸-高效聚合核苷酸
PCR循环
5’ 3’
变性、退火
引物
3’ 5’
延伸
变性、退火
延伸
PCR的指数扩增（2n）
一 易错PCR（error-prone PCR)




原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP 的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的 TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传 变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution) 操作手段：１）降低氯化镁的浓度 ２）是添加氯化锰 ３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者用核 苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 关键：选择适当的突变频率 优点：快速、简便、操作方便 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( < 800bp）
理性设计


两种方法打通了结构到功能关系，通过结构预测 功能或通过功能了解结构，使人类对蛋白结构和 功能关系有了更深入的了解，因此成为蛋白工程 的两样有力工具 因为通过定点突变可以向序列中引入关键残基和 结构元件,从而在定向进化中增加有益突变重组的 频率。另外,定向进化增加了理性设计知识,从而减 少了随机突变的序列空间,甚至为理性蛋白质设计 提供突变目标
手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。 （对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多， 试剂少，信号灵敏，自动化程度较高）
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
1
2
S
1
2
Y Q Tang, et al
85.4：15.8
72.6：29.1
各种酶与蛋白在酵母细胞表层的展示
5 细菌展示技术


革兰氏阴性菌的外膜蛋白仅有一些表面环可作为 插人外源蛋白的“ 允许位点” , 并且通常只允许 插入很短的外源蛋白。 单层膜转移 阳性菌结构坚固
革兰氏阳性菌的一个潜在 问题是其转化率较低。
DNA聚合酶（I 引物 dNTP Mg2+
II III）
Mullis的PCR构思
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+
Taq
P2 P1
Mg2+ dCTP
dTTP
dATP dGTP
改进 2 随机引导重组(RPR)


1998 年, Arnold 原理：用随机序列的引物来产生互补于模板序列不同部分的 大量的DNA 小片段 。 主要优点： 1) 合成的随机引物长度一致并缺乏序列的偏向性（不要求 等位）, 保证了点突变和交换在全长的后代基因中的随机 性。 2) 随机引导的DNA 合成不受DNA 模板长度的影响, 有 利于小肽的改造。
大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌
四 创造新的酶活性

Sun等利用组合突变改变了半乳糖氧化酶的底物专 一性，使其变为能以葡萄糖作为底物。 Sun, L. et al. (2002) ,Chem biochem 3, 781–783

李红梅等采用定向进化技术，改变了单加氧酶结构， 使其能催化长链脂肪酸底物变成催化苯环类底物。
目标酶
卡那霉素核苷 基转移酶 枯草杆菌蛋白 酶 β-内酰胺酶 对硝基苯酯酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性 第五特异性 基 因理疗 底物特异性 砷酸抗性
方法
定位诱变+选 择 易错PCR+选 择 DNA改组+选 择 易错PCR+重 组 交错延伸+选 择 DNA改组+选 择 DNA改组+选 择
2） 依据颜色变化筛选


颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对 硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释 放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。 下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一 个没有生色集团的底物的反应，需要将反应产物 转变为一个有色化合物。

同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋 白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
第一节 定向进化的特点
一 适合范围广 不同于理性设计，要求事先了解酶蛋白结构 二 目的性强 突变针对特定基因定向进行 筛选针对特定功能进行，如热稳定性 三 效果显著 短时间完成酶在自然界中几千年进化历程，且 进化方向符合人类社会需求。