最新高效液相色谱使用方法
高效液相色谱仪(Agilent1100型)操作步骤
一、开机1、开机前准备:流动相使用前必须过0.45um的滤膜(有机相的流动相必须为色谱纯;水相必须用新鲜注射用水,不能使用超过3天的注射用水,以防止长菌或长藻类);把流动相放入溶剂瓶中。
A瓶:为水相;B瓶:为有机相。
2、打开电脑,选Win 2000,进入Win 2000界面。
3、双击CAG Boodp server图标,放大CAG Boodp server小图标,出现窗口, 5min内打开液相各部件电源开关,等待1100广播信息后,表示通讯成功连接,关闭CAG Boodp serve窗口。
4、双击online图标,仪器自检,进入工作站。
该页面主要由以下几部分组成:——最上方为命令栏,依次为File,Run Control,Instrumen…等;——命令栏下方为快捷操作图标,如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等;——中部为工作站各部件的工作流程示意图;依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告;——中下部为动态监测信号;——右下部为色谱工作参数:进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。
4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。
二、编辑参数及方法1、开始编辑完整方法:从“Method”菜单中选择“New method”,出现DEF-LC.M,从“Method”菜单中选择“Edit entire method”,选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项,单击OK,进入下一画面。
2、方法信息:在“Method Comments”中加入方法的信息,如方法的用途等。
单击OK,进入下一画面。
3、泵参数设定:进入“Setup pump”画面,在“Flow” 处输入流量,如1ml/min;在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0,(A=100-B),也可在Insert 一行“Timetable”,编辑梯度;输入保留时间;在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。
hplc高效液相色谱仪使用方法
hplc高效液相色谱仪使用方法HPLC高效液相色谱仪是一种常用的色谱分析仪器，广泛应用于药物、环境、食品、化妆品等领域。
下面将详细介绍HPLC高效液相色谱仪的使用方法。
一、仪器准备：1.检查仪器的状态，确认各个部件是否正常运行，如高压泵、进样器、检测器等。
2.开机预热：打开主机电源，按照仪器操作手册上的指示，进行仪器的预热操作。
一般要求预热时间为30分钟到1小时。
二、工作站设置：1.打开工作站软件，点击新建分析方法。
根据分析需求选择不同的方法类型，如梯度洗脱、等温洗脱等。
2.设置流动相组成：根据分析物的性质和目标，选择合适的流动相，并设置其浓度和比例。
可以通过试错法或者文献参考来确定最佳流动相组成。
3.设置进样器参数：选择合适的进样方式，如全自动进样、微量进样等。
设置进样量和进样速度，根据分析物的浓度、检测器灵敏度等因素进行调整。
4.设置检测器参数：选择合适的检测器类型和波长。
一般情况下，紫外检测器是最常用的检测器，波长选择通常在200-400nm之间。
5.设置柱温：根据分析物的性质和目标，选择合适的柱温。
柱温对分离性能和分析速度有着明显的影响。
三、样品处理：1.样品制备：根据分析目标和方法要求，对样品进行处理，包括固相萃取、溶解、过滤等。
2.进样器设置：将样品注入进样器，确保进样量与方法要求相符。
3.进样：点击工作站软件上的进样按钮，开始进行进样。
进样过程中要确保无气泡进入柱。
四、开展分析：1.开始分析：点击工作站软件上的开始按钮，运行分析方法。
监控色谱图，观察峰的形状和分离度。
根据需要可以对分析方法进行优化，如调整流速、洗脱程序等。
2.数据处理：完成分析后，保存并导出色谱图和数据。
进行数据处理和结果分析。
五、仪器维护：1.使用完毕后，关闭泵和检测器，将柱中流动相完全排空，以免柱内残留物引起污染。
2.保养柱：每次使用后，要清洗柱和重新平衡柱。
柱的清洗和保养要根据具体的柱类型和使用情况进行。
3.保持仪器干燥和清洁：定期清洁仪器，尤其是注射器、透射比色噪声汇丰牌等易受污染的部件，以保证仪器的正常运行。
高效液相色谱柱的正确使用 液相色谱操作规程
高效液相色谱柱的正确使用液相色谱操作规程色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。
对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。
关于色谱柱的安装、维护、保色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。
对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。
关于色谱柱的安装、维护、保存以及由色谱柱导致的这样那样的色谱故障也是一门学问。
高效液相色谱柱的正确使用包含：加装保护柱，过滤流动相和样品，净化样品，避免过高的柱压，注意温度和酸碱度，正确及时的冲洗等。
1.加装保护柱保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。
尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污染,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。
保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。
保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(5～1次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。
2.过滤流动相和样品流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。
当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。
所配制的样品试液在注入流路系统前均要经.45μm(.22μm则更好)孔径滤膜过滤。
要注意区分水系和油系,二者不可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。
装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载而起不到过滤作用。
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱（HPLC）是一种用于分离和分析样品的精密仪器。
具体的使用方法如下：
1.准备工作：
○确保仪器电源已开启。
○安装∗∗谱柱和其他相关配件。
○准备样品和流动相。
2.建立方法：
○进入液相色谱仪的操作界面，选择适宜的色谱柱。
○设置流动相的种类、比例和流速。
○设置样品进样体积和积分时间。
3.进样：
○将样品溶液注入进样器。
○按下开始按钮，液相色谱仪会自动进行分离和检测。
4.数据处理：
○分析结束后，仪器会自动生成色谱图。
○通过数据分析软件对色谱图进行处理，获取目标物质的保留时间、峰面积等数据。
5.清洗和维护：
○实验结束后，关闭仪器电源。
○清洗色谱柱和其他配件。
○定期检查仪器状态，确保正常运行。
需要注意的是，具体操作步骤可能因仪器型号和实验需求而有所不同。
在使用液相色谱仪时，请务必参考相应的说明书并进行培训。
。
高效液相色谱的使用方法
高效液相色谱的使用方法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种用于分离、分析和测定混合物中组分的技术。
以下是高效液相色谱的使用方法：1. 样品制备：根据需要，样品可以通过溶解、浸提、纯化等方法进行前处理。
确保样品是均匀的，并且符合HPLC分析要求。
2. 选择合适的色谱柱：根据分析目标，选择合适的色谱柱，包括固定相（C18、C8、氨基、芳基等）和柱型（反相、离子交换、排除等）。
色谱柱质量对分离和分析结果至关重要。
3. 准备移动相：根据色谱柱要求和分析目标，选择合适的移动相。
移动相通常由溶剂和缓冲液组成，可以通过改变溶剂的组成和比例来调节色谱条件。
4. 设定色谱条件：根据需要，设定合适的色谱条件，包括流动相速度、柱温、检测波长等。
这些条件将直接影响分离的效果和分析的准确性。
5. 校准仪器：在开始分析之前，校准色谱仪和检测器，确保其准确性和稳定性。
校准通常包括检测器灵敏度、波长、流速等参数。
6. 注样和运行：将样品注入色谱柱，启动色谱仪，使移动相通过柱子，分离出样品中的各组分。
根据需要，通过改变运行时间、流速等参数，调节分离和分析的效果。
7. 数据分析：通过检测器检测样品中各组分的吸光度或荧光强度，并记录数据。
可以使用特定的色谱软件对数据进行处理和解析，以获得准确的分析结果。
8. 数据解释：根据分析结果，对样品中的各组分进行定量或定性的解释。
可以使用标准品进行定量分析，或者与已知数据进行比对，以确认各组分的身份和浓度。
9. 清洗和维护：在完成分析后，及时清洗色谱柱和仪器，以保持其性能和寿命。
根据需要，使用适当的溶剂进行清洗，并使仪器处于良好的工作状态。
总之，高效液相色谱的使用方法包括样品制备、色谱柱选择、移动相准备、色谱条件设定、校准仪器、注样和运行、数据分析、数据解释以及清洗和维护等步骤。
熟练掌握这些方法能够有效地进行高效液相色谱的分离和分析。
Waters高效液相色谱系统操作规程(入门)
1. 目的规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
2. 范围本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
3. 职责质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。
4. 系统组成本系统由Waters 600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne 7725i手动进样阀、Waters 2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。
5. 程序5.1. 准备5.1.1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45μm滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。
5.1.2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
5.2. 开机和泵操作5.2.1. 开机5.2.1.1. 接通断电保护器的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。
5.2.1.2. 打开Millennium32软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。
在Project档内选择所需的项目，右击『Run Samples』图标，选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。
5.2.2. 更换溶剂5.2.2.1. 打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；5.2.2.2. 将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；5.2.2.3. 按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；5.2.2.4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100%，其它为0%；5.2.2.5. 将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；5.2.2.6. 逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；5.2.2.7. 再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；5.2.2.8. 转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱测定含量的方法
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛用于测定化合物含量的分析技术。
以下是一般的HPLC测定含量的步骤和方法：
1.样品制备：根据分析的目的，准备含有目标化合物的样品。
样
品制备可能涉及提取、溶解、过滤等步骤。
2.标准曲线制备：准备一系列已知浓度的标准溶液，用于建立标
准曲线。
标准曲线上的点数通常越多越好，以提高测定的准确
性。
3.HPLC系统设置：设置HPLC系统，包括选择合适的色谱柱、
移动相（流动相）和检测器。
根据样品性质和目标分析物，选
择适当的柱和检测条件。
4.进样：将标准溶液和待测样品注入HPLC系统。
通常使用自动
进样器，以提高精度和重复性。
5.色谱条件优化：通过调整流速、温度等条件，优化色谱分离，
使目标化合物得到良好的分离和峰形。
6.数据采集和分析：使用检测器（如紫外-可见（UV-Vis）检测
器）记录样品在色谱柱中的吸收峰，并使用标准曲线计算目标
化合物的浓度。
7.质量控制：包括在分析中加入质量控制样品，以确保实验的准
确性和可靠性。
8.结果报告：报告目标化合物的浓度，通常以样品中目标化合物
的峰面积或峰高度与标准曲线的关系来表示。
需要注意的是，HPLC分析的方法会因分析的具体目的和分析物的性质而有所不同。
因此，在进行HPLC分析之前，建议参考相关的方法学文献、标准操作程序（SOP）或咨询有经验的分析师。
2695高效液相色谱操作规程
2695 系统操作规程一、准备：流动相：按方法要求配制流动相，经0.45m微孔滤膜过滤，并超声波脱气。
将清洗管路（不透明管）和洗针管路（绿管）分别放入适当的溶剂中。
洗针液（Needle Wash）：溶解样品的良好溶剂（不要使用缓冲盐或酸、碱作为洗针液）。
柱塞杆密封清洗溶液(Seal Wash)：5%-10%甲醇的超纯水二：开机及平衡系统：打开计算机登录windows后，依次打开2695、检测器的电源，等到仪器自检完毕后，进入Empower3软件。
2695面板Diag键，选择Prime SealWash，清洗泵头约1分钟；再选择Prime NdlWash，清洗进样针1-2次；将配制好的流动相放入2695顶部左侧槽中，按2695面板Menu/Status键进入手动控制模式；按2695面板Direct Function键，将需要使用的A/B/C/D管路分别进行WetPrime，流速7.5mL/min，时间3-5分钟；设置A/B/C/D管路的流动相比例，按2695面板Direct Function 键，进行WetPrime，流速7.5mL/min，时间3-5分钟按2695面板Direct Function键，选择Purge Injector，冲洗进样器；打开Empower3软件，点击运行样品，选择存放数据文件的项目和采集数据的系统，确定，建立仪器方法（设置2695的单次输送体积、流速、流动相比例、柱温；2489的模式、波长、采样速率；2475的模式3D或2D、激发（发射）波长、采样速率）和方法组；点击监视，观察基线，待基线平稳，可准备进样。
三、进样：将样品放入2695样品盘中，记录每一样品对应的管号；先在单进样状态进样一次，若条件适合，确定运行时间；在样品状态编辑样品表，开始自动进样。
四、数据处理及打印：浏览项目→选择项目→通道→选择标准样→查看t →按钮进入向导→选择新方法→处理类型为LC→设置峰宽、阈值、积分区域、最小面积、峰命名→保存处理方法。
高效液相色谱仪使用与操作规程
4 、检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正
常。
第二步、开 机
接通电源，依次开启不间断电源、四 元泵、自动进样器、柱温箱、检测器，待 泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、
主机，最后打开色谱工作站。
一）参数设定
1、 波长设定： 2 、流速设定： 3 、流动相规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积
的流动相。
检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。
观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。如
超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按检查管路后再操
作。
观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声
二、样品
1、采用过滤或离心方法处理样品，
确保样品中不含固体颗粒； 2、用流动相或比流动相弱（若为反
相柱，则极性比流动相大；若为
正相柱，则极性比流动相小）的 溶剂制备样品溶液，尽量用流动
相制备样品液；
3、手动进样时，进样量尽量小，使 用定量管定量时，进样体积应为 定量管的3～5倍；
第四步、注意事项
人的方法及实验结果；
3、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒， 洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针
筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
4、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过 滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用 5%稀硝酸溶液浸泡后再洗
四、出现肩峰或分叉
1.样品体积过大
1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰 的15% 2.样品溶剂过强 3.柱塌陷或形成短路通道 4.柱内烧结不锈钢失效 2.采用较弱的样品溶剂 3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程1.目的规范高效液相色谱分析仪的使用和维护。
2.范围高效液相色谱的使用和维护。
3.系统组成本系统由2487检测器（2414检测器），1515输液泵（1525输液泵），717自动进样器及EMPOWER系统组成。
4.程序4.1 流动相和样液制备4.1.1 过滤溶剂溶剂在使用前一定要用0.45μm的过滤器过滤。
4.1.2 保持储液瓶的清洁普通的溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子。
应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。
4.1.3 保证溶剂的质量一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲液。
将流动相过滤、脱气后，用封口膜及时封好待用。
将待测的液体样品经0.45μm的水相滤膜过滤后，滤液备用。
4.2 开机按照检测器、柱温箱、自动采样器、泵、计算机的顺序，依次接通电源。
每次使用示差折光检测器进行样品分析时，需要提前打开，预热稳定。
4.3 高压输液泵的操作4.3.1 液相色谱系统泵的流速在0.1-10.0ml/min之间，要保持泵的良好操作性能，必须维护系统的清洁，保证溶剂和试剂的质量，流动相的过滤和流动相的脱气。
下面列出预防泵故障的注意事项：（1）用高质量的试剂和HPLC级溶剂；（2）过滤流动相和溶剂；（3）脱气；（4）工作时使用泵头的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶剂冲洗柱塞杆；（5）不让水和腐蚀性溶剂滞留在泵中；（6）定期更换垫圈；（7）加润滑油。
处于良好操作状态的泵，应该使色谱图上的基线平稳，保留时间的重复性良好。
等度洗脱时压力波动小于±2%。
梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
4.3.2 常规准备工作包括：开通电源，溶剂脱气，泵头及溶剂管路除气泡及泵的启动。
4.3.3 接通系统电源，仪器各单元进行自检，数秒后通过，接受操作指令。
4.3.4 流动相脱气方式：超声波脱气10min。
4.3.5 系统中气泡的排除,泵启动时，调节所需要的通道流速为1ml/min，该通道调节为100%。
高效液相色谱质谱联用仪的使用方法
高效液相色谱质谱联用仪的使用方法高效液相色谱质谱联用仪（LC-MS）是一种广泛应用于生化分析、药物代谢研究、环境监测等领域的分析工具。
本文将详细介绍高效液相色谱质谱联用仪的使用方法，包括样品准备、设备操作和数据分析等方面。
一、样品准备1. 样品的选择与制备在进行LC-MS分析前，首先需要选择适合的样品进行测试。
样品的选择应基于实验的目的和研究对象。
样品制备要注意避免污染和失真，一般要进行样品提取、纯化和浓缩等步骤。
2. 样品溶解与稀释对于固体样品，可以选择合适的溶剂将其溶解，并根据需要进行稀释。
溶解和稀释过程中要注意保持样品的稳定性和一致性，避免对分析结果产生影响。
二、设备操作高效液相色谱质谱联用仪的操作步骤如下：1. 仪器开机与系统准备打开仪器电源，同时进行系统的准备工作。
包括启动色谱柱热箱和质谱仪，检查气源和溶剂供应等情况。
2. 参数设置与方法建立根据实验需要，设置合适的色谱条件和质谱参数。
包括进样量、流动相组成、流速、柱温等参数。
方法建立时要充分考虑分析物的性质和要求，确保分离和检测的准确性。
3. 样品进样与洗脱将预处理好的样品注入进样器进行进样。
根据方法要求进行样品洗脱，通常包括梯度洗脱、等温洗脱等步骤。
注意控制流速和温度，保证洗脱效果和色谱分离的质量。
4. 质谱检测与数据采集确保质谱仪的工作状态正常，进行质谱检测和数据采集。
根据实验要求选择合适的离子模式和检测模式，确保检测的准确性和灵敏度。
三、数据分析完成LC-MS分析后，需要对数据进行处理和分析，以获得所需的结果。
数据分析的步骤主要包括质谱图解析、峰识别和峰面积积分等。
1. 质谱图解析根据样品的特点和分析目的，对质谱图进行解析。
观察和分析相应的质谱峰，确定目标化合物的质量信息和碎片产物等。
2. 峰识别与峰面积积分通过峰识别算法，识别出样品中的不同成分并测量其峰面积。
根据峰面积可以计算出物质的相对含量。
3. 结果分析与报告根据实验目的和要求，对数据进行进一步的分析和解释。
高效液相色谱间接紫外检测法测定甲醇和乙醇含量
高效液相色谱间接紫外检测法测定甲醇和乙醇含量
高效液相色谱间接紫外检测法测定甲醇和乙醇含量的方法如下：
1.实验仪器：高效液相色谱仪、紫外-可见分光光度计、色谱柱。
2.试剂准备：使用水/甲醇(85/15, v/v)作为流动相，在pH 7.0的磷酸缓冲液(10
mmol/L)中加入0.1%的四丁基氢氧化铝用于调节离子强度。
准备甲醇和乙醇的标准品溶液。
3.样品处理：将待测甲醇和乙醇溶于流动相中，进行适当稀释，以满足仪器分析
的要求。
同时，准备一个纯溶剂的试样，作为空白对照。
4.色谱条件设置：使用C18反相色谱柱。
流量为1 mL/min，柱温为30℃，检测
波长为214 nm。
通过梯度洗脱和下述参数，完成甲醇和乙醇的分离。
5.制定标准曲线：分别加入不同浓度的标准品制成标准曲线。
6.分析样品：待测样品进行分离，记录对应的峰面积或峰高，并通过标准曲线计
算样品中甲醇和乙醇的含量。
7.峰验证：对所得的峰进行验证及识别，以确保检验结果的准确性。
总之，该方法通过高效液相色谱技术的显色反应，利用波长选择性，测定样品中甲醇和乙醇的含量，具有灵敏度高、准确性稳定、样品处理方便等优点，并且可广泛适用于饮料、食品、化妆品等领域的检测和分析。
高效液相色谱仪操作手册(戴安全自动)
液相色谱操作规程-U3000(全自动)一、操作前准备:1.1流动相的配制:1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。
1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜(0.45um)还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。
1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。
1.2对照品供试品处理:1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品,用适当的溶剂(最好采用流动相或流动相的主成分)进行充分溶解(也可借助超声波进行超声溶解),使其浓度为0.1~1mg/mL(根据检测结果再适当调节溶液的浓度)。
1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜(0.45um)还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。
1.3色谱柱的选择:根据样品的性质选择适当的色谱柱。
二、开机:2.1打开电源,打开仪器接线板电源开关;2.2打开电脑显示器电源,打开电脑主机电源,启动电脑;2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源;等待各个部件自检完成2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,关闭界面。
2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标(工作站主程序)。
2.6在左下方点击仪器,则在右边会自动显示该仪器控制面板2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上);设置A通道为100%,点击“冲洗”,然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”;(默认冲洗5分钟);然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡;排完气泡后关闭排液阀;2.8设置流动相的比例及流速后,点击“马达”。
此时泵自动会以设置的流速进行运行。
2.9在控制面板“自动进样器”控制框中,分别执行“灌注注射器”,“清洗缓冲环”,“清洗针外壁”,执行“到进样位置”;(操作过程中注意注射器有没有气泡。
如有先机器排气,如果不行手动拆除排气泡。
)3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中,设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。
高效液相色谱仪使用方法
高效液相色谱仪使用方法
高效液相色谱仪（HPLC）是一种常用的分析仪器，用于分离
和定量分析化合物的混合物。
以下是HPLC的基本使用方法：
1. 样品准备：将待分析的混合物或溶液准备好，通常需要进行前处理，例如过滤、稀释或提取。
2. 系统准备：打开色谱仪的电源，启动仪器，确保所有组件处于正常工作状态。
检查液相、气相和其他溶剂的供应，并确保其质量良好。
3. 进样：将样品注射器连接到色谱柱，并根据实验要求设置注射器体积。
将样品注射器插入进样口，并将样品注入到色谱柱。
4. 创建梯度：根据分析要求，创建一个梯度程序。
这涉及到设置流动相的组成和梯度变化的速率。
5. 运行分析：点击开始按钮，启动分析过程。
色谱系统将自动进行溶剂梯度变化，使样品中的化合物逐步从色谱柱中分离出来。
6. 数据采集和分析：在分离过程中，色谱仪将采集到一系列数据点，包括峰高、峰面积、保留时间等。
使用相关的数据处理软件，可以对这些数据进行处理和分析。
7. 清洗和维护：在分析完成后，需要进行系统的清洗和维护。
这包括冲洗色谱柱、清理进样器和其他组件，并储存色谱仪在
正确的环境条件下。
以上是高效液相色谱仪的基本使用方法。
具体的使用流程和操作步骤可能会有细微的差异，取决于具体的仪器品牌和型号。
建议在使用前仔细阅读和理解相关的操作手册和使用说明。
高效液相色谱HPLC操作步骤及问题集锦
等浓度洗脱：开机步骤：1.配有机相，体积≥200ml（空瓶子先装满肥皂水超声10min，再用自来水冲洗10次，蒸馏水洗4次），砂滤（用有机膜，光面向上，瓶中液体快到瓶口时放气防止倒吸），室温超声10min。
开电源总开关，开计算机，开柱温箱开关，开SPD-15C开关，LC-15C开关。
2. 开purge阀，把A管从纯甲醇中取出，靠壁几秒后放入有机相中，purge，绿灯闪后关purge阀，把废液瓶放地上。
3.打开软件，系统设置：确认添加LC-15C(A) ，确认柱温箱为（室温较低35℃，室温较高30℃）简单设置：LC时间：60min 波长：215nm模式：等浓度洗脱总流速：0.6ml/min——下载（有机相较少时改流速为0.5ml/min）点泵开关走基线60min，拔六通阀处塞子和橡胶帽。
（若压力线与基线相差过大，则点击显示设置，修改强度范围，再点击检测器零点，快走平时调回原来的强度范围）4. 基线走完，不关泵开关，点击单次运行，改文件名和存储位置。
5. 纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；取待测样品，用0.22um滤膜过滤至2ml EP管中，每针进样量≥40ul。
若管中出现气泡，则拉活塞使气泡变大，用纸捏住针头，推活塞把气泡打入纸中再进样。
6.进样时，先将针插入六通阀中快而匀速的将活塞推到底，再掰下阀，则仪器自动开始走线。
关机步骤：方法一：1.测样结束，点击停止，关泵开关，待压力降为0，开purge阀，将A管从有机相中取出，靠壁几秒后放回纯甲醇中，purge，绿灯闪后关purge阀。
2.简单设置：总流速：1.0ml/min——下载点泵开关，洗脱柱子30min3. 在开始洗柱子时，用纯甲醇洗针三次，每次＞60ul；用针吸取纯甲醇洗六通阀，每次≥60ul，将针插入六通阀，推进活塞后掰下阀，间隔0.5min，把阀掰上，再洗下一针，重复洗三次，等待洗脱柱子完成。
（纯甲醇当天用不完的应丢弃）4.黑线走平，即表明洗脱柱子结束，关泵开关，收针，塞回塞子和橡胶帽，关软件，关LC-15C开关，关SPD-15C开关，关柱温箱开关，关机，关电源总开关。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法一、流动相准备将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。
流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。
二、开机首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。
三、抽气抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。
抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。
四、调节流动相比例与流速在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。
五、2410示差检测器的使用1、打开2410示差检测器开关2、调整检测器内、外温度3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。
六、2487紫外检测器的使用1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。
2、设置检测波长3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定一、样品准备取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。
配80％甲醇，冰箱冷冻。
二、提取样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。
小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。
三、过滤取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。
四、浓缩将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。
高效液相色谱法的标准操作程序
1目的：规定了高效液相色谱法的标准操作程序，便于规范操作。
2适用范围：适用于公司内用高效液相色谱法检测的产品。
3责任人：QC。
4程序内容4.1 简述4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后,各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理得到测定结果。
4.1.2常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
4.1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。
检测器最常用的为可变波长紫外光检测器或紫外-可见光检测器，色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
4.2 高效液相色谱仪的使用要求4.2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。
4.2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
4.2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
4.3 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光度法进行溶剂检查应符合要求。
水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
对规定PH值的流动相应使用精密PH计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45μm适宜的滤膜滤过，用前应脱气。
应配制足量的流动相及时待用。
4.3.1 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配成供试溶液。
定量测定时，对照品溶液配制1份，样品供试溶液配制2份。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
最新高效液相色谱使用方法
一、流动相准备
将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。
流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。
二、开机
首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；
打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。
三、抽气
抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。
抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。
四、调节流动相比例与流速
在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。
五、2410示差检测器的使用
1、打开2410示差检测器开关
2、调整检测器内、外温度
3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。
六、2487紫外检测器的使用
1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。
2、设置检测波长
3、预热30分钟左右，即可注样测定。
试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定
一、样品准备
取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。
配80％甲醇，冰箱冷冻。
二、提取
样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。
小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。
三、过滤
取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。
四、浓缩
将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。
五、萃取
提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。
六、过柱纯化
萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。
七、二次浓缩
液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。
八、过滤
0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。
九、测定与计算
用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。
进样量为20ul。
测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55
计算：通过曲线计算样品中激素浓度。
试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定
一、取样
称取样品（番茄(甜瓜)果肉重1～2 g、叶肉（无大叶脉）2g）→置于试管（带玻璃试管塞）→倒入80％乙醇，浸没样品约1cm→80℃水浴1h→冷却后封存。
二、提取
倒出乙醇提取液入25ml容量瓶→再向试管中加入80％乙醇，80℃水浴1h，如此反复提取次→合并提取液后定容
三、浓缩
取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。
四、过滤
用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45μm滤膜。
若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。
C18小柱使用方法：
C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇
五、HPLC测定
测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35℃，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。
试验六：蔗糖代谢酶的测定
一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值）
1、50m M HePes—NaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升)
50 m M HePes：11.9150g
NaCl:16.0 g
kCl::0.74
Na2HPO4.12H2O:0.543
葡萄糖：2
1m M EDTA:0.3722
10 m M MgCl:2.0330
2.5 m M DTT :0.3856 ()
10 m M Vc 1.7614
2 、PVPP:固体
3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8）
0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ）
0.1M柠檬酸(21.01g/L 10.14ml )
4、0.1M NaHPO4-柠檬酸PH：7.2
0.2M NaHPO4 17.39 ml
0.1M柠檬酸 2.61 ml
5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml
6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml
7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中
8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至100 ml
9、0.05M F-6-P
0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml
10、UDPG：0.205g/25ml
11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸
12、5 nM MgCl2
13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml
14、0.05M 果糖。
15、DNS试剂
将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。
二、样品测定
.1g样品冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆四层纱
+ 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes
布过滤12000g(4℃) 弃沉淀上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟)
20分钟
使之完全溶解12000g(4℃) 弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀移到透析
20分钟
袋中用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4℃培养箱中透析20小时(以上操作均在
0～4℃下进行)
㈠、酸性,中性转化酶的测定(μmol Glucos e·h-1·g-1FW)
⒈①酸性转化酶
0.6ml(0.1M Na2HPO4柠檬酸PH4.8 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)
②中性转化酶
0.6ml(0.1M K2HPO4柠檬酸PH7.2 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)
⒉总体积为1ml(放在小离心管中)
37℃孵育30分钟后转到试管中+1ml蒸馏水+1.5ml 3,5-二硝基水杨酸（DNS）
空白2ml蒸馏水
沸水浴5分钟流水冷却每管中加21。
5ml蒸馏水520nm比色。
㈡、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性测定(μmol Sucros e·h-1·g-1FW)
⒈①蔗糖合成酶
0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml(0.0082 g/ml UDPG)+0.1ml(0.1M Tris)+0。
1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液
②蔗糖磷酸合成酶
0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1ml(0.1M Tris)+0。
1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液
⒉上述反应在37℃保温30分钟 100℃水浴1分钟定容至1ml
调零1ml蒸馏水
+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却转到试管中+3.5ml(30%HCl)
+1ml(0.1%间苯二酚)（用95%乙醇溶液）摇匀80℃水浴10分钟流水冷却480nm比色
蔗糖标准曲线配制
每支试管中+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却+3.5ml(30% HCl) 1ml(0.1%间苯二酚) 摇匀80℃水浴10分钟流水冷却540nm比色。