最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法

一、流动相准备

将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。

二、开机

首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；

打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。

三、抽气

抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。

抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。

四、调节流动相比例与流速

在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。

五、2410示差检测器的使用

1、打开2410示差检测器开关

2、调整检测器内、外温度

3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。

六、2487紫外检测器的使用

1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。

2、设置检测波长

3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定

一、样品准备

取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。

二、提取

样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。

三、过滤

取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。

四、浓缩

将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。

五、萃取

提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。

六、过柱纯化

萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。

七、二次浓缩

液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。

八、过滤

0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。

九、测定与计算

用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。

测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55

计算：通过曲线计算样品中激素浓度。

试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定

一、取样

称取样品（番茄(甜瓜)果肉重1～2 g、叶肉（无大叶脉）2g）→置于试管（带玻璃试管塞）→倒入80％乙醇，浸没样品约1cm→80℃水浴1h→冷却后封存。

二、提取

倒出乙醇提取液入25ml容量瓶→再向试管中加入80％乙醇，80℃水浴1h，如此反复提取次→合并提取液后定容

三、浓缩

取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。

四、过滤

用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45μm滤膜。若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。

C18小柱使用方法：

C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇

五、HPLC测定

测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35℃，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。

试验六：蔗糖代谢酶的测定

一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值）

1、50m M HePes—NaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升)

50 m M HePes：11.9150g

NaCl:16.0 g

kCl::0.74

Na2HPO4.12H2O:0.543

葡萄糖：2

1m M EDTA:0.3722

10 m M MgCl:2.0330

2.5 m M DTT :0.3856 ()

10 m M Vc 1.7614

2 、PVPP:固体

3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8）

0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ）

0.1M柠檬酸(21.01g/L 10.14ml )

4、0.1M NaHPO4-柠檬酸PH：7.2

0.2M NaHPO4 17.39 ml

0.1M柠檬酸 2.61 ml

5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml

6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml

7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中

8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至100 ml

9、0.05M F-6-P

0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml

10、UDPG：0.205g/25ml

11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸

12、5 nM MgCl2

13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml

14、0.05M 果糖。

15、DNS试剂

将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。

二、样品测定

.1g样品冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆四层纱

+ 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes

布过滤12000g(4℃) 弃沉淀上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟)

20分钟

使之完全溶解12000g(4℃) 弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀移到透析

20分钟

袋中用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4℃培养箱中透析20小时(以上操作均在

0～4℃下进行)