荧光原位杂交技术FISH

荧光原位杂交技术FISH

1 目的

通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。

2材料与仪器

2.1材料

件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次；

72℃再延伸8 min。

2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产

物，并用微量分光光度计测定其浓度。

3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase

inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。

4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。

6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于

-80℃放置20 min。

7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃

离心10 min沉淀RNA。

8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴

定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。

3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果

1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和

100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。

2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。

3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min

以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含

0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后

于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。

4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育

16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。

5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase

buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。

6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min，

再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。

7) 次日于TNT中洗涤3次，每次10 min，在用0.1mol/L PB浸洗10 min，接着进行

TSA-Biotin(1:3000)信号放大反应，后在0.1mol/L PB浸洗10 min，TNT溶液中室温浸洗2次后加入FITC-avidin(1:1000)的TBS溶液避光孵育3 h，后将组织切片于室温条件下TNT溶液中洗涤3次，每次10 min。

8) 在原位杂交完成后，用细胞核标志物DAPI进行衬染。

9) 然后进行裱片、封片，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。

4结果分析

图1为荧光原位杂交实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。运用标记的两条Brd2 cRNA反义探针，在小鼠脑组织切片进行荧光原位杂交反应，用DAPI进行衬染。同时设立省略探针的阴性对照。同样实验条件下，两条反义探针得到杂交结果相一致，在小鼠大脑皮质中可见清晰的绿色的Brd2杂交信号，而省略探针的切片无任何杂交信号。

以上结果表明，所制备的探针具有较好的特异性。

图1荧光原位杂交实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价；A.D为设计的第一条探针；B.E为设计的第

二条探针；C.F组为设立省略探针阴性对照。