暴露式与非暴露式气管滴注方法建立小鼠急性肺损伤模型及其效果比较

［文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４１４－

０５［收稿日期］　２０１２－０１－

０４［基金项目］　国家自然科学基金资助课题（８１１０００３０

）［作者简介］　苗雨丹（１９７７－）

，女，吉林省白城市人，讲师，医学硕士，主要从事临床解剖学方面的研究。［通信作者］　李　波（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４６６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｂｏ＠ｊ

ｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）；董春玲（Ｔｅｌ：０４３１－８８７９６８２０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｃｈｕｎｌｉｎｇ

＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ）网络出版时间：　２０１２－０４－１７　

０９：１３网络出版地址：　ｈｔｔｐ

：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２２．１３４２．ｒ．２０１１１１０１．０９１１．００４．ｈｔｍｌ暴露式与非暴露式气管滴注方法建立小鼠急性

肺损伤模型及其效果比较

苗雨丹１，董春玲２，刘　玲１，夏长丽１，苏　略１，李　波１

（１．吉林大学白求恩医学院人体解剖学系，吉林长春１３００２１；

２．吉林大学第二医院呼吸内科，吉林长春１３００４１

）［摘　要］　目的：比较暴露式与非暴露式气管滴注方法建立的小鼠急性肺损伤（

ＡＬＩ）模型的各种指标，确立更有效的气管滴注方法。方法：４５只健康雄性Ｃ５７／ＢＬ６小鼠随机分为对照组、非暴露组和暴露组，每组１５只。以

脂多糖（ＬＰＳ）作为刺激物，非暴露组和暴露组小鼠分别采用非暴露式和暴露式气管滴注方法建立ＡＬＩ模型，造

模后２４ｈ进行支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）生化指标检测、ＢＡＬＦ细胞分类计数、肺湿／干重（Ｗ／Ｄ）

比值测定以及肺组织病理形态学观察。结果：暴露组小鼠造模的成功率（１００％）高于非暴露组（８６．７％）

。与对照组比较，非暴露组和暴露组小鼠ＢＡＬＦ中总蛋白浓度、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）

活性、中性粒细胞数量以及肺Ｗ／Ｄ比值显著升高（Ｐ＜０．０５）；暴露组小鼠ＢＡＬＦ总蛋白浓度、ＡＬＰ和ＬＤＨ活性、中性粒细胞数量以及肺Ｗ／Ｄ比值明显高于非暴露组（Ｐ＜０．０５

）。非暴露组小鼠主要表现为肺间质水肿；暴露组小鼠主要表现为渗出性肺水肿。结论：暴露式气管滴注方法对于建立小鼠ＡＬＩ模型更有效。

［关键词］　气管滴注；急性肺损伤；脂多糖；小鼠

［中图分类号］　Ｒ５６３ ［文献标志码］　Ａ

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ　

ｗｉｔｈｅｘｐｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｅｘｐ

ｏｓｅｄ　ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｃｏｍｐ

ａｒｉｓｏｎＭＩＡＯ　Ｙｕ－ｄａｎ１，ＤＯＮＧ　Ｃｈｕｎ－ｌｉｎｇ２，ＬＩＵ　ｌｉｎｇ１，ＸＩＡ　Ｃｈａｎｇ

－ｌｉ　１，ＳＵ　Ｌｕｅ１，ＬＩ　Ｂｏ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｎａｔｏｍｙ，Ｎｏｒｍａｎ　Ｂｅｔｈｕｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ

ｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　

Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ

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ｉｎｊｕｒｙ（ＡＬＩ）ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙｅｘｐ

ｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｗｈｉｃｈ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒｔｙ－ｆｉｖｅ　ｍａｌｅ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ　

ａｎｄ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｆｉｆｔｅｅｎ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐ

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４１４第３８卷　第３期２０１２年５月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３　Ｍａｙ

　２０１２

ｉｎ　ＢＡＬＦ，ｌｕｎｇ　ｗｅｔ／ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔ（Ｗ／Ｄ）ｒａｔｉｏ，ａｎｄ　ｐａｔｈｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　２４ｈ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｓｕｃｃｅｓｓ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＡＬＩ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ（１００％）ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ（８６．７％）．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＢＡＬＦ，ｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）ａｎｄ　ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｉｎ　ＢＡＬＦ，ａｎｄｌｕｎｇ　Ｗ／Ｄ　ｒａｔｉｏ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＢＡＬＦ，ｔｈｅ　ＡＬＰ　ａｎｄ　ＬＤＨ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ　ｉｎ　ＢＡＬＦａｎｄ　ｌｕｎｇ　Ｗ／Ｄ　ｒａｔｉｏ　ｉｎ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｅｄｅｍａ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｅｘｕｄａｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｅｄｅｍａ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｉｎ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅｍｏｒｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ＡＬＩ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ　ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ；ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ；ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｍｉｃｅ

急性肺损伤（ａｃｕｔｅ　ｌｕｎｇ　ｉｎｊｕｒｙ，ＡＬＩ）和急性呼吸窘迫综合征（ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｔｒｅｓｓｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＲＤＳ）是指心源性以外的各种肺内外致病因素所诱发的过度炎症反应、肺泡和毛细血管膜结构损伤以及氧合功能严重障碍的临床综合征。ＡＬＩ和ＡＲＤＳ属于同一疾病过程的２个发展阶段，ＡＬＩ代表早期、病情相对较轻的阶段，而ＡＲＤＳ代表ＡＬＩ发生后期病情较严重的阶段，是严重的ＡＬＩ。迄今，ＡＬＩ／ＡＲＤＳ的发病机制尚未完全阐明，临床上对于ＡＬＩ／ＡＲＤＳ患者除肺保护性机械通气外并没有其他有效的治疗手段，ＡＬＩ／ＡＲＤＳ的死亡率仍然高达约５０％［１］。动物模型的建立及其应用对于进一步揭示ＡＬＩ／ＡＲＤＳ发病机制、提高诊疗效率具有重要意义［２］。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞外膜成分，主要致病物质是脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ），ＬＰＳ进入机体可建立感染后的ＡＬＩ模型。

１９２３年Ｋｉｍｕｒａ首次用气管滴注法研究了煤焦油对兔子和豚鼠的致瘤性［３－５］。从上世纪的七十年代起，气管滴注法得到了广泛的应用。依据是否暴露气管，气管滴注法可以分为非暴露式和暴露式２种。非暴露式气管滴注法是将滴注用的导管通过喉部插入气管内进行滴注；而暴露式气管滴注法是指在实验动物的颈腹面切个小口暴露出气管，用针头直接刺入气管进行滴注。目前，非暴露式和暴露式气管滴注法在建立ＡＬＩ动物模型方面均得到了广泛的应用［６－７］。但至今为止，对于２种气管滴注方法的造模效果尚缺乏客观、系统的评价。本研究采用非暴露式和暴露式（改进后）气管滴注方法建立内毒素性小鼠ＡＬＩ模型，对２种气管滴注方法造模的成功率及其效果进行客观、系统的评价。同时确立一种更加行之有效的气管滴注方法，旨在为阐明ＡＬＩ的发病机制奠定理论基础。１　材料与方法

１．１　动物和试剂　４５只成年雄性Ｃ５７／ＢＬ６小鼠，６～８周龄，体质量１８～２２ｇ，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。ＬＰＳ（Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ　０５５∶Ｂ５）购自Ｓｉｇｍａ公司。实验设计经动物保护委员会同意，动物使用和处理遵照美国国立卫生署颁布的“实验动物关护和使用指南”。

１．２　实验分组及模型制备　４５只健康雄性Ｃ５７／ＢＬ６小鼠随机分为对照组、非暴露组和暴露组，每组１５只。以ＬＰＳ作为刺激物，非暴露组和暴露组分别采用非暴露式和暴露式气管滴注方法建立ＡＬＩ模型。各组于造模后２４ｈ收集标本。每只小鼠腹腔注射１００μＬ戊巴比妥钠（１０ｇ·Ｌ－１）进行麻醉，麻醉生效后进行非暴露式或暴露式气管滴注。非暴露式气管滴注方法同文献［８］，将末端连有１ｍＬ注射器的无菌塑料管经口插入气管内，滴注１００μＬ　ＬＰＳ溶液（溶于生理盐水，５ｍｇ·ｋｇ－１）；暴露式气管滴注方法进行适当改进，小鼠头向上仰卧于一块木板上，木板倾斜与水平面呈５０°角，在小鼠颈部做一纵行切口，暴露气管，使用末端连有１ｍＬ注射器的小儿头皮针，经气管壁插入气管内，将预先吸好的１００μＬ　ＬＰＳ溶液以及１００μＬ空气快速滴注至小鼠肺内。气管滴注后将小鼠直立，垂直旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布，从而建立内毒素性小鼠ＡＬＩ模型。

１．３　各组小鼠生化指标检测及细胞分类计数　每组取５只小鼠，处死后，固定在操作台上，暴露气管后用一次性静脉留置针进行气管插管，丝线结扎固定，然后取生理盐水用１ｍＬ注射器进行支气管肺泡灌洗。灌洗时，每次取１ｍＬ生理盐水，经气管套管冲洗双侧支气管肺泡，反复注入回吸３次后回收支气管肺泡灌洗液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ　ｌａｖａｇｅ

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苗雨丹，等．　暴露式与非暴露式气管滴注方法建立小鼠急性肺损伤模型及其效果比较