慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南慢使用操作指南1.慢简介1.1 定义：慢是一种特殊的，能够在细胞中长期存活并进行复制。
1.2 用途：慢广泛应用于基因转导、基因敲除和基因表达等实验研究中。
2.慢使用前准备工作2.1 实验室准备工作2.1.1 实验室空间准备：确保实验室内有足够的操作空间和合适的消毒设备。
2.1.2 材料准备：准备好所需的培养基、细胞培养物、慢载体等。
2.1.3 设备准备：确保离心机、冰箱等设备正常工作，并准备好相关的仪器和器材。
2.2 人员准备工作2.2.1 人员培训：对参与慢操作的人员进行培训，了解操作步骤和安全风险。
2.2.2 个人防护：提供必要的防护装备，如实验服、手套、面罩等。
3.慢操作步骤3.1 细胞培养3.1.1 细胞培养物准备：根据实验需求选择合适的细胞培养物，并进行细胞的预处理和培养。
3.1.2 细胞密度调整：根据实验要求，调整细胞培养物的密度，以保证细胞的正常生长。
3.2 慢感染3.2.1 慢载体注射：将慢载体注射到培养好的细胞中。
3.2.2 感染条件控制：根据实验需求，控制慢感染的时间、浓度和温度等条件。
3.3 细胞培养和检测3.3.1 细胞培养：将感染好的细胞进行培养，并观察细胞的生长状态。
3.3.2 细胞检测：使用相关实验方法，对感染细胞进行检测和分析。
4.实验安全措施4.1 操作环境控制：确保实验室内通风良好，避免慢的扩散和污染。
4.2 废液处理：将产生的废液经过正确处理，避免对环境和人体造成污染和伤害。
4.3 事故应急处理：在发生事故或意外情况时，立即采取应急措施，并及时报告相关人员。
5.附件本文档所涉及的附件，包括但不限于实验记录表格、实验数据文件等。
6.法律名词及注释6.1 慢：指一种具有长周期和潜伏期的。
7.结束语感谢您阅读本文档，如有任何疑问或意见，请随时与我们联系。
慢病毒感染细胞 操作手册
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
慢病毒感染细胞 操作手册
实验步骤：
1．准备目的细胞
1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml 含 完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml 灭菌的D-Hank’s 溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml 胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养
慢病毒感染细胞 操作手册
实验流程描述
培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养，感染 当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧光显微镜下 观察GFP 表达情况，荧光率达80％以上，待细胞长满培养板收集细胞检测。
实验材料：
试剂
试剂名称 胎牛血清 FBS DMSO DMEM 胰酶 Opti-MEM
2． 目的细胞慢病毒感染
1) 处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为5×104）接种于6-well 中，37℃ 5%CO2 培养箱培养待细胞融 合度达到约30% 3) 根据细胞MOI 值，加入适宜量的病毒 4) 12h 后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h 后更换培养基；如 果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基 5) 感染3 天后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况，荧光率大于80%者，将细胞分成两 分，一份分于12孔培养板中待长满后收集细胞用于RNA提取，一份分于6孔板中待长满后收集 细胞用于蛋白提取；感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验 6) 以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上，它不需要提前 一天分盘。操作时将细胞离心后悬浮在不同的培养基中，计数分盘后，就可以加入病毒。 操作时污染了病毒的管子和枪头以及培养基和最后的细胞都CO2 培养箱 生物安全柜
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。
2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。
3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。
4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。
5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。
6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。
7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。
8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。
本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。
关于慢病毒感染的相关知识总结讲解
慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。
混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。
慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。
慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
关于慢病毒感染的相关知识总结
慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。
混匀分装后4℃保存(请尽量在三天用完) 分装后使用。
二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。
慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。
慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。
慢病毒包装及质粒转染手册
使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。
4．短暂离心使管壁液体流下。
5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。
7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。
本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。
第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。
它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。
2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。
- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。
第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。
根据实验需要选择合适的载体。
2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。
3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。
可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。
4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。
通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。
5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。
第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。
2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。
定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。
3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。
慢病毒收毒及纯化 SOP
慢病毒收毒及纯化标准操作细则1. 目的：规范慢病毒收毒及纯化标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒收毒及纯化操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、50ml离心管，移液枪、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜, 15ml超滤管、0.22μm滤膜、50mL无菌注射器、1mL无菌注射器,离心机3.2溶液准备OMEM培养基,1640培养基，FBS（gemini）3.3操作步骤3.3.1收集转染后48小时的细胞上清液于一个50ml离心管中，并更换10mL新的1640培养基，72小时（从转染开始计时）后再收集一次，并混合到一起。
3.3.2 4000rpm，离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤收集好的上清液到新的50ml离心管中。
3.3.3准备一个15ml的超滤管，将过滤收集的上清液，根据上清液毫升数，分批次加入超滤管中（每次大约加入5ml）进行离心，4000rpm，离心10-15分钟，根据具体情况调整离心时间。
3.3.4每离心完成一次后，把管底部的废液弃掉，再加入新的上清液继续离心，最后一次离心完后，超滤管中保留500ul左右的病毒液，然后用移液器反复吹悬超滤管中病毒液，转移到无菌的EP管中。
3.3.5收集重悬后的慢病毒浓缩液于1.5mL离心管中，并做好标记，以10000rpm离心5min，以进一步去除其他杂质颗粒。
3.3.6用一支2mL注射器收集离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤于另一支干净的1.5mL EP管中，做好标记。
3.3.7根据需要将过滤后的样品进行小体积（50μL或20μL）分装，保留部分样品～20μL用于滴度检测，并做好标记，贴好标签。
填写入库记录，并将分装好的病毒进行入库，保存于-80℃冰箱。
3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
3.4.2操作室台面用75%酒精擦拭消毒后，开启紫外灯进行灭菌。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南一、慢病毒的储存与稀释：1.?病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4?℃注：AB2.?PBS)，分二、慢病毒用于体外（in?vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.?慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI?值）以及在体内（in?vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI?值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）2.?慢病毒感染目的细胞预实验①?A．?Hela）? BC．度为②?以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T?细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100?μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
第二天，观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验：1准确计2a?b?c?在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液d?混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育过夜注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前，细胞处于良好的生长状态。
如果慢病毒对目的细胞的感染效率偏低，则可以通过提高MOI?值来增加其感染效率，但是当MOI?高于20?时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8?μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。
4小时候1.?病毒操作时最好使用生物安全柜。
如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。
2.?病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。
3.?操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。
慢病毒使用操作指南
慢病毒使用操作指南1. 引言1.1 目的本文档旨在提供关于慢病毒使用的详细操作指南，以确保实验室人员能够正确、安全地处理和利用该种类病毒。
2. 概述2.1 定义与特点- 慢病毒是一类具有复制缓激活机制并且感染后可长期存在于寄主体内的RNA或DNA 症候群相关性（SAR）等多个领域中发挥重要作用。
3. 实验前准备工作在进行任何涉及到潜在危险生物材料如此类型之前, 快速评估风险，并采取适当措施来最小化这些风险。
4 . 材料清单：下面列出了完成所需任务时可能需要的基本设备和试剂: - 生物安全柜级别II (BSL-2) 或更高级别环境下进行所有步骤；- 防护手套、防护眼镜/面罩和实验服;...5 . 实验流程：进行以下步骤以成功执行您对操纵蠕虫样品库存的需求:5.1 准备工作- 确保实验室环境符合慢病毒操作所需要的生物安全级别；- 检查所有设备和试剂是否齐全并处于良好状态。
5.2 培养基准备：...6 . 安全注意事项与风险评估7 . 应急措施及处理方法8 . 相关法律名词及注释：在本文档中，以下是一些常见使用到的法律名词以及其相应解释说明。
a) 生物安全柜 (Biosafety Cabinet, BSC):是用来提供对人员、产品和环境进行防护，并且在其中进行微生物学或细胞培养等活动时，提供无菌条件下能够有效地限制有害因素扩散传播而又不影响正常运行过程。
9. 结束语本文档涵盖了详尽的慢病毒使用操作指南，旨在确保实验室人员正确理解并遵循相关规定以最大程度上降低任何可能存在的危险性。
10. 文档涉及附件：请参考随信发送之文件列表。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。
25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒用户使用手册
慢病毒用户使用手册1.慢病毒概述慢病毒（Lentivirus）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它可以感染分裂细胞和非分裂细胞，可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。
此外，慢病毒具有嗜核性，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而可以在体内较长期表达。
慢病毒的多种优点，使它成为基因传递的强大而有效的工具，获得了广泛的应用。
2.慢病毒安全操作规范锐赛生物提供的是第三代的慢病毒载体系统，包括1个慢病毒表达载体和3个包装辅助质粒，大大降低了发生同源重组的概率，降低了产生复制能力病毒的可能性。
同时，本系统的慢病毒颗粒是自身失活型（SIV）病毒，即病毒感染靶细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，从而提高了安全性。
尽管如此，该病毒仍然具有潜在的生物学危险，因此建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假病毒进行生物学实验。
此外，建议将本系统生产的慢病毒视为二级生物安全水平的生物，使用时请参照如下基础规范进行实验：1.在进入实验室工作时，穿着实验服或隔离服，戴上手套和口罩。
2.操作病毒时请尽量使用生物安全柜，小心不要产生气雾或液体飞溅。
3.如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的风机（由于超净台风向外排，有可能将病毒吹向操作者），并尽快操作；尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间，封闭所有含有病毒的容器、耗材、废液后，再打开超净台风机。
4.如果操作时台面有病毒污染，请立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡过夜后弃去。
5.如需离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后离心。
6.实验结束，脱掉手套前先消毒再摘除手套，随后用肥皂洗手。
关于慢病毒感染的相关知识总结
慢病毒使用操作手册一、慢病毒得储存与稀释:1、病毒得储存:收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4 ℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)①病毒可以存放于-80℃6个月以上;但如果病毒储存时间超过6个月,建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次得使用量进行分装。
2、病毒得稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用培养目得细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。
混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
二、慢病毒用于体外(In Vitro)实验:感染培养原代细胞与建系细胞。
慢病毒对各种细胞与组织得亲嗜性不同,在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献,了解慢病毒对您得目得细胞得亲嗜性,感染复数(MOI 值)以及在体(In Vivo)注射所需要得病毒量。
如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适得感染复数(MOI 值)(使用24孔板检测病毒对目得细胞得亲嗜性)。
慢病毒感染目得细胞预实验1、慢病毒感染目得细胞预实验注意事项:①测定慢病毒对目得细胞得亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高得细胞(HEK293T,Hela)作为平行实验得对照细胞。
②在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目得细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其她营养因子得完全培养基不影响慢病毒得感染效率。
③一般慢病毒单位为TU/ml,即每毫升中含有具有生物活性得病毒颗粒数。
如:病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性得慢病毒颗粒。
2、以24孔培养板为例,进行目得细胞与HEK293T 细胞得感染预实验实验前按照不同得MOI设置不同得感染孔,并根据MOI与细胞数量计算所需要得病毒量,如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
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慢病毒生产及使用操作手册
当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细 胞数量，维持细胞良好的生长状态。
（三）做脂转 complex DMEM 需在 37 度水浴中预热，LipFiterTM 转染试剂需恢复至室温方可使用，
使用前需摇匀。
转染每瓶 T75 的 complex 成分如下：
pspax
10μg
PMD2G pHBLVTM 系列载体
10μg 10μg
转染后 6h 换新鲜培液。
注：LipoFiterTM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipoFiterTM 说明书。 LipoFiterTM 转染最适的细胞密度为 50%-70%。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册
一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体 分别进行高
纯度无内毒素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩 病毒。
2） 包装质粒信息如下： PSPAX2 及 PMD2G 载体图谱和序列信息 (购自 addgene)
2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养 基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
（二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25%
胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞
于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪
用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打
（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n 万/mL 细胞浓度。
传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺 900-1000 万/T75；若第三天转染，
铺 350-400 万/T75。每瓶 T75 加 10mL 10％DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，
60％满即可进行转染。转染前无需换培养基。
慢病毒生产及使用操作手册
随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止 此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性 和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入 PBS 洗去残留的培养基； 2、加入 0.25%的胰酶，消化 1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙 加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM， 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所 有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大 格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为 实际 n 万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基 +20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为 3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时 复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T 细胞的传代
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慢病毒生产及使用操作手册
（一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1g/l,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。质粒抽提完毕需跑胶确定质粒质量。
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用途 过表达 干扰
其他载体
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慢病毒载体 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、 pHBLV CMVIE-Puro pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6puro 还有其他荧光标记和启动子混搭载体，以及 tet-on 系统高表达/干扰系列载体，详情可咨 询公司分子生物学技术工程师。
三、包装细胞 293T 细胞的培养 （一） 293T 细胞的冻存
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详细的细胞数/MOI/病毒体积换算参见附 1 表格；部分细胞 MOI 建议及 polybrene 适用情况参见附 2 表格。
3.感染步骤：4 小时小体积感染法 按实验需要将细胞铺板（比如 12 孔板）。细胞数以第 2 天密度约 50%为宜。
37℃ 培养过夜。 对于 Polybrene 可施加的细胞：准备完全培养基和 Polybrene 混合物，
可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将
所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中
计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，பைடு நூலகம்数除以 4
2）Polybrene 预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系 MOI 及 Polybrene 的 使用参见附表 2。
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定
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MOI 一般以 1：3：5 或者 1:3:10 进行梯度摸索，一般的细胞基础慢病毒感 染 MOI 可以 10 为开始，即 10，30，50 或者 10，30，100。 MOI 对应病毒体积的换算 转染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2 计算）×MOI=病毒个数；则加入的病 毒体积数=病毒个数/病毒滴度。 例子：转染细胞数为 105 个，MOI 为 10，则需要病毒的个数为 106 个，病毒如果 滴度为 108 IU/ml,则需要加入的病毒体积为 106/（108 IU/ml）=10-2ml=10ul。同 理，30，50 相应为 30ul，50ul。
1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到 10cm 培养皿中，每个培养皿补足到 10ml 培养基。 4、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 （三）293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现 污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为 37℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完 全溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养 皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。 四、慢病毒包装和浓缩
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慢病毒生产及使用操作手册
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒 数。通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 慢
病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适 MOI 各有差别，原则上最适 MOI 是感染效率较好的最低 MOI。原则上每种细胞对应每种类型的病毒都应该进 行最适 MOI 摸索实验，设置 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pHBLVTM 系列质粒。
1、载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下：
各载体用途如下表：
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Polybrene 终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 1/2 体积，即 0.25 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于 24 孔板，其他孔板请相应 调整体积，具体参考《病毒小培养体积感染表》），37℃小体积感染 4 小时，4 小时后补齐含同等浓度 Polybrene 培养基至正常体积，即 0.5ml（24 孔板）。