生物技术实验解析

实验一酵母细胞的固定化

1.实验目的

掌握酵母细胞的固定化方法。

2.原理

利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。

3.试剂和仪器设备

鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计

4.实验步骤

（1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。

（2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。

（3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。

（4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。

（5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。

5.实验数据及其处理

记录固定化酵母细胞的质量。

固定化酵母细胞的质量为：0.75g

6.问题讨论

如何验证固定化酵母细胞的催化能力？

(1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状

如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。

（2）观察发酵的葡萄糖溶液

利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。

（3）检查凝胶的黏性和弹性。

思想感悟

经过这次酵母细胞的固定化实验，我不仅掌握了酵母细胞的固定化方法，同时也通过对注射器的使用，明白了固定化细胞时，针头应垂直于液面且保持较近的距离，同时注射时速度应相应提高，以保证自液面下落的固定化酵母直径较小，因为缓慢低价会导致在流出针头时，由于黏弹力会使液体聚集形成较大的液滴，而快速注射形成水流则会避免该现象。

实验二蛋白的酶解及水解度的测定

1．实验目的

通过本实验，要求掌握酶水解蛋白质和测定水解度的原理，并掌握蛋白质水解度的测定方法。

2．原理

（1）蛋白质酶水解.

蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。与酸碱催化的水解反应相比，它的反应条件温和，副反应少，水解效率高。酶水解蛋白质主要受温度、pH值、加酶量、底物浓度及反应时间的影响。根据不同的蛋白水解酶及底物情况，可设定不同的水解条件进行反应，作比较后，选择最佳的反应条件。

（2）水解度测定方法

当蛋白质中的肽键全部被水解生成氨基酸时，则水解度为100％，没有被水解时，其水解度为0。由于蛋白质水解时每裂解一个肽键就生成一个-NH2和一个-COOH基，因此，在测定蛋白质水解度时，只要定量的测定新生成的-NH2和-COOH基的量就可以计算出h值，这样就可以算出蛋白质的水解度。常见的测定水解度的方法有甲醛固定法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(TNBS)、三氯乙酸法和pH-STAT法。本试验采用茚三酮法测定蛋白质的水解度，其原理如下：

茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应生成氨，茚三酮、反应产物氨和还原性茚三酮共同反应，生成紫色化合物。利用化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

3.试剂和仪器设备

(1) 材料：地鳖酶解液

(2) 试剂：10％NaOH 溶液、标准L-亮氨酸（固体）、1％SDS溶液、0.2125M的磷酸缓冲溶

液（pH8.2）、茚三酮、KIO3、0.1N的HCl溶液、Arazyme蛋白酶(5000U/g)

(3) 仪器设备：粉碎机、磁力搅拌机，pH计、离心机、旋转式恒温振荡器、紫外可见分光

光度计、分析天平、电子秤、移液管（1mL、10mL）

4．实验步骤：

⑴试剂的配制

① 0.5mmol/L甘氨酸标准储备液制备：准确称取37.53mg甘氨酸定容至1000mL容量瓶中，于0℃条件下保存备用；甘氨酸标准使用液制备: 分别吸取上述溶液0.0、0.2、0.4、0.6、

0.8、1.0mL于试管中，用蒸馏水补足至1mL，相当于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L；

②碘酸钾KIO3稀释液制备：称取1.0g碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300mL，再加入200mL95%乙醇溶液，混匀备用；

③茚三酮显色剂制备：称取0.5g茚三酮，用95%乙醇溶解并定容至100mL，此溶液在

低温条件下用棕色试剂瓶可保存两周。

④ pH 5.4，2mol/L醋酸缓冲液：A 2mol/L醋酸 20mL冰醋酸加入到173mL蒸馏水中，混匀；B 2mol/LNaAc 50gNaAc用305mL蒸馏水溶解，混匀；用A将B调节到pH 5.4。

⑵原料处理

选取干地鳖虫或榨油后的水分含量低，用粉碎机以60目过筛对原料进行粉碎。

⑶加水调酸：每次取粉碎好的原料5.0g放入250mL的三角瓶中，按料水比1：20加蒸馏水

到三角瓶中，将料液混匀。用10％NaOH溶液调节料液的pH值到8.2，混匀。

⑷酶解：向已调pH值的料液中加入Arazyme蛋白酶0.3000g，将三角瓶置入旋转式恒温振荡器内，在37℃、150r/min进行酶解。

⑸灭酶：水解1小时后，取出三角瓶在80℃下灭酶15min。

⑹离心分离：5000r/min下离心10min，倒出上清液即水解液，稀释20倍备用。

⑺水解度的测定：

①标准曲线的制定：取25mL磨口具塞比色管6支，分别加入甘氨酸标准溶液1.0mL，再向各管分别加入pH5.4 2mol/L醋酸缓冲液，茚三酮显色剂各1.0mL，再向各管中加入蒸馏水，使各管的总体积为5.0mL，摇匀、盖塞、在沸水浴中加热15min后，取出，用冷水冷却15min，再向各管中加入5.0mL KIO3稀释液并摇匀，30min后于570nm测其吸光度。

标准曲线的绘制：

y=2.6409x-0.0544

R2=0.9322

②测定水解液的水解度：取水解液1.0mL，再向各管分别加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液，