Southern Blot操作流程

Southern Blot 操作流程

1、哺乳动物基因组DNA 的提取（或用OMEGA 试剂盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit ） 1、 取约30mg 样品，加入600 ul SNET ，再加入12 ul （20.2mg/ml ）的蛋白酶

K ，使蛋白酶K 的终浓度为400ug/ml ； 2、 55℃振荡过夜；

3、 加入0.6 ul RNaseA ，室温下孵育10 min ，后置于65℃ 10 min ；

4、 加入300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和12 ul 异戊醇，室温下振荡30 min ；

5、 17,000 g 离心5min ，转移上层水相（600 ul ）至一新的离心管；

6、 加入等体积（600 ul ）的异丙醇沉淀DNA ，于4℃下13,250 g 离心15 min ；

7、 小心除去异丙醇，加入1 ml 70%的乙醇。离心5 min 后除去乙醇，室温下干

燥15~20 min ；

8、 加入100 ul TE ，使核酸沉淀溶解。

一、 酶切

1、 拷贝数的计算

哺乳动物基因组全长3.0×109个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下：

()

g

plasmid

of mass bp

bp DNA of Insertion

μ10100.39

=

⨯

2、 酶切体系

基因组DNA 10 ug 10*Buffer 10 ul 酶(10U/ul) 10 ul Total

100 ul

3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切反应；

4、 对酶切产物进行纯化，用30 ul TE 洗脱；

5、 制备1%浓度的琼脂糖凝胶（不加EB ）；

6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于70℃放置15 min ，以除尽残留乙醇和消除

酶切后产生的粘性末端；

7、电泳：1v/cm。

二、转膜

1、碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理15 min；重复一次；

2、中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理15 min；重复一次；

3、倒出中和液，加入20×SSC，摇床处理15 min；

4、转膜：

1）在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入20×SSC，浸湿；

2）放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸，倒上一层20×SSC，防止产生

气泡；

3）将预先剪裁好的尼龙膜放入ddH2O中充分浸润2分钟；

4）小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；

5）往胶上倒上一层20×SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20×SSC；6）再放上一张与胶条大小相当的sigma 3M滤纸；

7）用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约250mg的物体压在吸水纸上面；

8）转膜过夜；

5、固定

将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上面，使含DNA面朝上，放入紫外交联仪中，以1.5J，254n，2.5min的程序将DNA固定在尼龙膜上。

三、杂交

1、标记探针：可用随机引物法或PCR方法标记探针；

2、将尼龙膜有DNA 的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，加入10 ml 经预热至50℃的DIG Easy Hyb，于50℃预杂交30 min；

3、取10 ul经标记的探针，热水浴5 min变性，然后迅速放入冰水混合物中；

4、将变性后的探针加入4 ml预热的DIG Easy Hyb中，混匀，并防止气泡的产生（气泡会产生背景）；

5、倒出预杂交液，加入含探针的杂交液，杂交4h或过夜。

6、杂交温度的计算

T m=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）[I=length of hybrid in base pairs]

T opt= T m-20 to 25℃

四、洗膜

1、室温下用W1洗液洗5min，重复一次；

2、68℃下用W2洗液洗15min，重复一次；

3、将膜用Washing Buffer浸润5min；

4、25~50℃下，用100ml Blocking Solution孵育30min，保持摇动；

5、25~50℃下，用20ml Antibody Solution孵育30min，保持摇动；

6、用100ml Washing Buffer洗15min，重复一次；

7、用20ml Detection Buffer平衡5min；

8、将膜放入杂交袋中，使含DNA面朝上，滴加1ml CSPD ready-to-use，将杂交袋合上，并赶走气泡，于15~25℃孵育5min；

9、挤出多余的液体，将潮湿的膜置于37℃孵育10min，以增强发光反应。

五、显影

直接用成像系统成像。

DNA提取的溶液配制

1.Tris-HCl (1mol/L ；PH 8.0)

用800ml蒸馏水溶解12.1g Tris碱，加浓HCl（约42ml）调PH至8.0，应使溶液冷却至室温后，方可最后调定PH值，加水定容至1L。高压灭菌。

***如果溶液出现黄色，应予以丢弃，并使用质量更好的Tris。

2.EDTA（0.5 mol/L ；PH 8.0）

186.1 g EDTA·Na·2H2O加入800ml水中，用NaOH调节PH至8.0（约需20gNaOH），定容至1L，高压灭菌。

***EDTA·Na需在PH接近8.0时才会溶解。

3.NaCl (5 mol/L)

292g NaCl加入800ml水中，定容至1L，高压灭菌。

4.SDS（20%，m/v）十二烷基磺酸钠

200g SDS加入900ml水中，加热到68℃有助于溶解，定容至1L。

***无须灭菌，不要蒸汽高压。

5.SNET

20 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)

5 mmol/L EDTA(PH 8.0)

400 mmol/L NaCl

1%(m/v) SDS

6.TE(PH 8.0)

100 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)

10 mmol/L EDTA(PH 8.0)