HPLC-仪器验证方案

注：以上人员签字后方可实施本草案
WATERS2695高效液相色谱仪验证方案目录
1.0再确认目的
2.0再确认项目及结果
2.1 仪器各单元开机性能确认
2.2 四元泵的确认
2.2.1 泵流量的确认
2.2.2 梯度准确度的确认
2.3自动进样器确认
2.3.1进样器精密度的确认
2.3.2进样器线性的确认
2.4检测器确认
2.4.1波长准确度测试
2.4.2 检测器线性的确认
2.4.3 最小检测浓度的确认
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WATERS2695高效液相色谱仪再确认方案
1.0再确认目的
通过验证来确认此台仪器各项性能是否符合要求。

2.0再确认项目
2.1仪器各单元开机性能确认
2.2 四元泵的确认 2.2.1 泵流量的确认
2.2.1.1 测试条件：
流动相：超纯水 色谱柱：4.6mm ×250mm 温度：室温 2.2.1.2 测试方法：
启动仪器，以水为流动相，待压力稳定后，在流动相出口处用称重过的10ml 容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，收集5分钟流出的流动相，精密称定，每个流速测定3次，记录测试温度，按下式计算流量设定值误差Ss 和流量稳定性误差S R 。

%100)(⨯-=S S m S F F F S %100)(min max ⨯-=m R F F F S
式中：F m ——F m =（W 2－W 1）/（ρ·t ），流量实测值，ml/min ；
W 2——容量瓶＋流动相的质量，g ； W 1——容量瓶的质量，g ；
ρ——试验温度下水的密度，g/ml ； t ——收集流动相的时间，min ；
m F ——同一组测量值的算术平均值，ml/min ；
F s ——流量设定值，ml/min ；
F max ——同一组测量中流量最大值，ml/min ；
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F min——同一组测量中流量最小值，ml/min。

2.2.1.3 测试标准：
2.2.2 梯度准确度的确认
2.2.2.1测试条件：
流动相：0.3%丙酮-水检测波长：254nm
流速：1.000ml/min 柱温：30℃
2.2.2.2 测试方法：
按下表设置梯度洗脱程序，以两通代替色谱柱连接管路，先用超纯水冲洗系统，待基线平稳后开始执行梯度程序，画出梯度变化曲线。

测定三次，取各梯度级高度的平均值，由曲线图测量100%B （C）梯度级平均高度计算各梯级实际体积%，每个梯级的理论体积%和实际体积%之差即为梯度准确度，以最大差值为梯度准确度误差。

梯度洗脱表
2.2.2.3 测试标准：梯度准确度误差≤±1%
2.3 自动进样器的确认
2.3.1 进样器精密度的确认
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2.3.1.1 测试条件：
流动相：乙腈-水（20:80）对照品：25µg/ml咖啡因对照溶液
色谱柱：C18色谱柱检测波长：273nm
进样量：10µl 流速：1.000ml/min
柱温：40℃
2.3.1.2 测试方法：
对照品置于进样瓶中，共进样6针，记录峰面积，求6针RSD。

2.3.1.3 测试标准：RSD≤1.5%
2.3.2 进样器线性的确认
2.3.2.1 测试条件：
流动相：乙腈-水（20:80）对照品：25µg/ml咖啡因对照溶液
色谱柱：C18色谱柱检测波长：273nm
进样量：（1、5、10、15、20）µl 流速：1.000ml/min
柱温：40℃
2.3.2.2 测试方法：
对照品置于进样瓶中，不同进样量各进一针，记录峰面积，求进样浓度与峰面积的相关系数。

2.3.2.3 测试标准：相关系数r≥0.999
2.4 检测器的确认
2.4.1波长准确度测试
以水流过流通池时作一空白扫描，然后，以手动方式将咖啡因标样5)用水稀释10倍后注入流通池，扫描200nm～300nm范围内的紫外吸收图谱。

记录咖啡因最大吸收和最小吸收处的波长，其205nm处的最大吸收波长与205nm比较，其273nm处的最大吸收波长与273nm比较，最小吸收波长与245nm比较，三波长处的差值|△λ|均应≤2nm。

波长检查表（表35）
选择波长（nm）205 (max.) 245 (min.) 273(max.)
实测波长（nm）
误差（nm）
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2.4.2 检测器线性的确认
2.4.2.1测试条件：
流动相：乙腈-水（20:80）对照品：（5、10、25、50、100）µg/ml咖啡因对照溶液
色谱柱：C18色谱柱检测波长：273nm
进样量：10µl 流速：1.000ml/min
柱温：40℃
2.4.2.2 测试方法：
5个浓度对照品置于不同进样瓶中，各进一针，记录峰面积，求样品浓度与峰面积的相关系数。

2.4.4.3 测试标准：相关系数r≥0.999
2.4.3 最小检测浓度的确认
2.4.
3.1 测试条件：
流动相：乙腈-水（20:80）对照品：1×10-7/ml咖啡因对照溶液
色谱柱：C18色谱柱检测波长：273nm
进样量：5µl 流速1.000ml/min
柱温：40℃
2.4.
3.2 测试方法：
以流动相冲洗系统至基线平稳，进样，记录色谱图，由色谱图峰高及基线噪音，按下式计算最小检测浓度C L
H C
N C d
L ∙
=
2
式中：C L——最小检测浓度，g/ml；
Nd——基线噪音峰高，mAU；
C——标准溶液浓度，g/ml；
H——标准溶液色谱峰高，mAU。

2.4.
3.3 测试标准：≤1×10-7 g/ml咖啡因溶液
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