氧氟沙星人工抗原的合成及鉴定

氧氟沙星人工抗原的合成及鉴定

潘孝成1,2,祁克宗1＊,朱良强3,涂建1,张小飞2,赵瑞宏2　

(1.安徽农业大学,安徽合肥230036;2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;3.安徽省兽医总站,安徽合肥230001)

摘要　采用碳二亚胺法制备了氧氟沙星与牛血清白蛋白(B SA)及卵清蛋白(OV A)的结合物,通过FeCl3显色反应,紫外扫描以及动物免疫证明了人工抗原的成功合成。经紫外光谱法测定,每分子牛血清白蛋白连接的氧氟沙星分子数为11.16个;每分子卵清蛋白连接的氧氟沙星分子数为5.9个。

关键词　氧氟沙星;碳二亚胺法;人工抗原

中图分类号　S482.2 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2006)03-0487-02

Synthesis and Identifi cation of Oflo xacin Artificia l Antigen

PA N Xiao-cheng et a l　(An hui Agricultural Un iversit y,H efei,Anh ui230036)

A bstract　Carbod iimide m eth od was em ployed in th e s ynt hesis of ofloxacin(OFL)with carriin g proteins bovin e s erum al bum in(

B S A)an d ovalbu min (OV A).Th e

C onj ugation of OFL-B S A and OFL-OV A was identified wit h FeCl3,UV Sp ectru m and im mun iz ing anim al.11.16ofloxacin m olecules were linked to a molecule of the BS A,5.9ofloxacin m olecu les were lin ked to a molecule of th e OV A.

Key w ords　Ofloxacin;Carbodiim ide method;Artificial antigen

氧氟沙星(Ofloxac in,OFL)是氟喹诺酮类抗菌药物,有抗菌谱广、抗菌活性强等优点[1],因此在畜禽及水产养殖业中有比较广泛的应用[2]。但是此类药物在动物性食品中的残留可能会对人及环境造成潜在的损害,另外随着耐氟喹诺酮类药物的耐药菌株越来越多,不仅会影响动物疾病的控制,更为严重的是影响人类疾病的控制[3～6]。因此其残留问题日益受到人们的重视。

目前已知可用于测定氧氟沙星在动物组织中残留的检测方法有高效液相色谱法(HPL C),液相色谱—质谱联用法(L C-MS),荧光检测法等[6,7]。但由于其前处理较复杂,所需仪器较昂贵,亦不能适应于大量样品的快速检测。免疫分析法具有快速、灵敏度高、特异性强、仪器要求不高等优点,检测限可以达到ng至pg水平级,适于大量样品的快速检测,已经广泛应用于农药、激素、兽药及其他化学残留物的检测[8～11]。由于氧氟沙星是小分子物质,没有免疫原性,必须与大分子物质结合成完全抗原才具有免疫原性。该实验采用碳二亚胺法[7,12～16],分别以牛血清白蛋白(BS A)、卵清蛋白(OV A)作为载体蛋白,合成了两种氧氟沙星的完全抗原,为建立检测O FL在动物组织中残留的免疫分析法奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

1.1.1　试剂。牛血清白蛋白(BSA,M w:68000)、卵清白蛋白(OVA,Mw:45000)、乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)均为上海源聚生物有限公司产品;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为上海伯奥生物科技有限公司产品;氧氟沙星(OFL),含量99.5%,批号0411016,中国兽药监察所产品;二甲基甲酰胺(D MF),分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司产品;FeCl3·6H2O>99%500g分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂公司产品;0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH值8.0)。

1.1.2　仪器。紫外可见光扫描仪(U V-2501P C型;SHI-

基金项目　安徽省优秀青年科技基金(04041042)。

作者简介　潘孝成(1971-),男,安徽霍邱人,在读硕士,助理研究员,从事动物疫病病理与食品安全的研究。＊通讯作者。

收稿日期　2005-09-28MAD ZU);2K15型离心机(SI GMA);J A2003型上皿电子天平; HL-5型多功能搅拌器。

1.2　人工抗原的合成　包括:免疫用抗原[OFL-BSA];包被用抗原[OFL-OVA]。采用的是碳二亚胺法,略作改动。反应过程如下:

具体的合成步骤:

(1)称取OFL39.36mg放入50ml的小烧杯中加入6ml 的D MF中溶解,再分别加入122mg的EDC、46.4mg的N HS、6ml的双蒸水,用保鲜纸封口,在暗室中,磁力搅拌90r/min 室温反应24h成A液。

(2)称取158.4mg BS A或159.2mg OV A分别放入100ml 的小烧杯中加入20ml0.01mol/L、pH值8.0的PBS中溶解成B液。将A液逐滴加入B液中,边加边用磁力搅拌器搅拌,室温90r/min反应6h。

(3)将反应液装入24h前用0.01mol/L、pH值8.0PB S浸泡过夜的透析袋中,按1∶100(V∶V)4℃搅拌条件下在0.01mol/L、pH值8.0PB S中透析3d,每12h更换1次透析液。每次换液时收集适量的透析外液(每次10ml)。收集经透析后的反应液并粗略估计其体积,分装,-20℃保存备用。

1.3　人工抗原的鉴定

1.3.1　FeCl3显色反应。彻底透析的人工抗原溶液(OFL-BSA、OFL-OVA)、透析外液分别加入一定浓度的FeCl3溶液,观察实验结果。

1.3.2　紫外光谱法。紫外扫描是用最后一次透析的透析外液调零,同时设OFL、BSA与OVA对照。对彻底透析的免疫抗原(OF L-BSA)和包被抗原(OFL-O VA)等进行紫外扫描分析,OFL-BSA、OFL-O VA、BSA、OVA都配制成0.22mg/ml; OFL配制成0.020mg/ml。在240～440n m范围内扫描,并记录下各种物质的扫描图谱及各种物质在240～440n m范围内的吸收值,通过比较载体蛋白在交联后的图谱变化进行初步分析判断。并根据紫外扫描的数据计算OFL-BSA、OFL-O VA的结合比(每分子载体蛋白质连接的半抗原数

安徽农业科学,Journal of An hu i Agri.Sci.2006,34(3):487-488,602 责任编辑　孙红忠　责任校对　孙红忠